Organoidi cerebrali
Tecnologia degli organoidi per la comprensione dello sviluppo cerebrale e delle malattie neuronali
Organoidi cerebrali
Gli organoidi cerebrali sono modelli tissutali 3D derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (human induced Pluripotent Stem Cells, hiPSC). In coltura, le cellule staminali si differenziano in varie cellule neurali che maturano nel tempo fino a formare strutture simili a regioni cerebrali come il proencefalo (cerebrale) o il mesencefalo.
La coltura di organoidi complessi come gli organoidi cerebrali è una tecnologia in rapida evoluzione che ha un enorme potenziale nelle aree della neurobiologia dello sviluppo e della neurodegenerazione. Progressi recenti hanno reso possibile la coltura di organoidi cerebrali a partire da iPSC, permettendo lo studio dello sviluppo corticale e delle malattie ad esso associate. Sono necessarie ulteriori ricerche affinché gli organoidi cerebrali possano essere utilizzati su larga scala per gli studi di genomica funzionale, la scoperta farmacologica e la valutazione degli effetti tossici indotti dai composti.
Passaggi generali per lo sviluppo di organoidi cerebrali derivati da iPSC
Gli organoidi cerebrali sono stati coltivati in base al protocollo adattato messo a punto da Lancaster & Knoblich, 2014. In questa metodica, gli organoidi cerebrali vengono coltivati in un terreno di coltura che promuove l’auto-organizzazione e il patterning.
- Giorno 0 - Formazione di corpi embrioidi (Embryoid Bodies, EB): le cellule iPSC sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti ad attacco ultra basso
- Giorno 2-5 - Differenziamento dello strato germinale: fornitura di nutrienti e monitoraggio degli EB
- Giorno 5 - Induzione neurale: trasferimento in una piastra a 24 pozzetti contenente il terreno di induzione neurale
- Giorno 7 - Trasferimento in goccioline di Matrigel: i tessuti neuroectodermici vengono trasferiti in goccioline di Matrigel
- Giorno 8-10 - Espansione degli abbozzi neuroepiteliali: si verifica la crescita degli abbozzi neuroepiteliali, che si espandono e presentano un lume pieno di liquido
- Giorno 11 - Maturazione: i tessuti vengono trasferiti in un bioreattore rotante per promuovere la crescita e l’espansione
Principali passaggi per la generazione di organoidi cerebrali derivati da iPSC. Il protocollo utilizzato è basato su quello di Lancaster et. al., che prevede l’impiego di terreni di STEMCELL Technologies.
Monitoraggio di organoidi cerebrali 3D in via di sviluppo mediante l’uso di strumenti analitici basati sull’IA
Le dimensioni e la morfologia di microtessuti cerebrali in via di sviluppo sono state monitorate utilizzando strumenti analitici basati sull’IA, come il nostro software di analisi delle immagini IN Carta®, per definire le dimensioni e la forma dei tessuti. Microtessuti selezionati sono stati analizzati mediante imaging confocale durante fasi diverse dello sviluppo per valutare l’organizzazione delle cellule mediante l’espressione di diversi marcatori neuronali.
Figura 2. Analisi di immagini in campo chiaro mediante funzioni di segmentazione basate sull’IA. A) È stato eseguito il monitoraggio delle dimensioni degli EB prima di procedere alla fase di induzione neurale. Sono mostrati esempi di immagini e le relative maschere di segmentazione ottenute mediante lo strumento SINAP del software IN Carta. B) Istogramma che mostra la distribuzione del diametro degli EB. Classe dimensionale = 10 μm. C) La maturazione degli organoidi può essere monitorata utilizzando l’imaging in campo chiaro e analizzata mediante lo strumento SINAP del software IN Carta. Barra di scala = 100 μm.
Imaging del calcio su organoidi cerebrali per determinare l’attività neuronale
Per la rilevazione delle attività funzionali, gli organoidi sono stati trattati con coloranti sensibili al calcio, dopodiché le oscillazioni del Ca2+ sono state registrate con il sistema di imaging ad alto contenuto ImageXpress® Confocal HT.ai e analizzate con il software di acquisizione e analisi delle immagini ad alto contenuto MetaXpress® per la valutazione dei picchi cinetici. Nel complesso dimostriamo che l’uso dell’imaging ad alto contenuto combinato con l’analisi basata sull’IA su organoidi cerebrali 3D è uno strumento promettente per lo screening di composti e le valutazioni di tossicità.
Figura 3. Sincronizzazione dell’attività del calcio entro la settimana 13. A) Immagine che mostra una sezione ottica di organoidi trattati con calcio 6. B) L’intensità del calcio misurata nella regione inclusa nel riquadro è rappresentata come intensità media nel tempo. C) Vista in dettaglio della regione inclusa nel riquadro in (A) mostrata nel tempo. Le frecce indicano un’intensità elevata. Le immagini in basso rappresentano l’intensità del calcio sotto forma di mappa di calore. Notare l’intensità che si diffonde a partire dallo spike iniziale, a suggerire la presenza di una rete neuronale.
Risorsa in primo piano
Processi automatizzati di monitoraggio dello sviluppo e analisi dell’attività di organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC
Qui descriviamo un metodo per la coltura e il monitoraggio semi-automatizzati degli organoidi cerebrali, nonché per l’esecuzione di test funzionali dell’attività neuronale attraverso la registrazione delle oscillazioni del Ca2+. L’imaging in campo chiaro con segmentazione basata sull’intelligenza artificiale (IA) può aiutare a monitorare la qualità degli organoidi in via di sviluppo mediante la rilevazione della forma e dell’aumento del diametro. L’attività neuronale degli organoidi cerebrali può essere determinata in base all’attività del calcio. L’imaging confocale permette di rivelare l’attività del calcio per determinare la maturità dei neuroni. Inoltre, l’organizzazione cellulare può essere monitorata mediante imaging confocale con colorazione differenziale.
Ultime risorse sulla ricerca sugli organoidi
Una maggiore diffusione dei modelli basati sugli organoidi nella ricerca e nello screening di farmaci è ancora ostacolata dalla complessità dei saggi 3D. La disponibilità di nuovi strumenti avanzati di imaging e di analisi e l’automazione dei saggi sono cruciali per aumentare la qualità delle informazioni, il rendimento e la precisione dei modelli biologici complessi. Scoprite in che modo le soluzioni di imaging e analisi ad alto contenuto e ad alto rendimento, combinate con strumenti analitici basati sull’IA, possono migliorare l’accuratezza dei vostri studi sugli organoidi.