Contatore di cellule
Al contatore di cellule: cellule A431
La linea cellulare di carcinoma epidermoide A431 esprime livelli anormalmente elevati di recettore del fattore di crescita dell'epidermide (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) e rappresenta un utile modello per lo studio della segnalazione mediata dall’EGFR, che regola la crescita, la sopravvivenza, la proliferazione e il differenziamento delle cellule di mammifero. Derivate dall’epidermide di una paziente di 85 anni e messe in coltura da D. J. Giard et al., le cellule A431 si sono dimostrate un utile sistema modello per lo studio del ciclo cellulare, dell’apoptosi e dei tumori.
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Figura 1: immagini ottenute utilizzando il citometro SpectraMax MiniMax
Le cellule A431 sono state colorate con il colorante EarlyTox™ Live Red Dye e poi sottoposte a imaging utilizzando il citometro SpectraMax MiniMax. Le cellule sono state identificate con un’impostazione personalizzata definita dall’utente. In alto: immagini ottenute in luce trasmessa sovrapposte a quelle ottenute con una colorazione fluorescente rossa. In basso: cellule identificate mediante analisi StainFree (le maschere viola indicano le cellule identificate dal software).
Figura 2: conte cellulari con la tecnologia StainFree e con colorante fluorescente
Cellule A431 sono state seminate a densità comprese tra 156 e 20.000 cellule per pozzetto e i nuclei sono stati colorati utilizzando il colorante EarlyTox Live Red Dye. Sono state acquisite immagini relative a 4 siti per pozzetto ed è stata selezionata per l’analisi una regione di interesse al centro dei pozzetti. Il numero di cellule presenti è stato poi determinato utilizzando il metodo StainFree (tracciato blu) o contando i nuclei fluorescenti rossi (tracciato rosso).
Figura 3: saggio EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488
Le cellule A431 sono state trattate con diluizioni seriali di staurosporina (tracciato rosso), camptotecina (tracciato verde) ed etoposide (tracciato blu) per 24 ore e poi analizzate per rilevare l’apoptosi utilizzando il kit del saggio EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488. Le cellule che esprimevano la caspasi-3/7 erano colorate in verde fluorescente e sono state visualizzate e contate con il citometro SpectraMax MiniMax. I risultati sono stati riportati in grafico come numero di cellule apoptotiche in funzione della concentrazione del composto utilizzando il software SoftMax Pro.
Suggerimento:
Le cellule A431 presentano una morfologia epiteliale e tendono a crescere formando aggregati, una caratteristica che le rende alquanto difficili da contare. Per la conta con la tecnologia StainFree, selezionare “Create New Setting” (Crea nuova impostazione) e utilizzare lo strumento di disegno giallo per tracciare i contorni delle cellule senza fuoriuscire dai bordi cellulari. Utilizzare lo strumento di disegno blu per indicare le aree non coperte da cellule ed eventuali artefatti.
Kit di strumenti per l’analisi delle cellule A431
- Piattaforma di rilevazione per micropiastre multimodale SpectraMax ® i3
- Citometro per imaging SpectraMax ® MiniMax™ 300
- Software SoftMax ® Pro
Luce trasmessa (TL)
713 nm (fluorescenza rossa)
Esposizione in TL: 7 ms
Regolazione del fuoco in TL: 0 µm
Esposizione 713: 12 ms
Regolazione del fuoco 713: 20 µm
Tipo di analisi: Analisi di oggetti distinti
Lunghezza d’onda per l’identificazione di oggetti: TL (StainFree) o 713 (nuclei rossi)
TL: Create new setting (Crea nuova impostazione) (personalizzata)
713: Impostare dimensioni e intensità: Dimensioni = 10-30 µm, Intensità al di sopra del background = 70
Informazione sulla tecnologia di rilevazione cellulare StainFree
Solitamente, i saggi di imaging basati su cellule richiedono l’uso di sonde fluorescenti che possono essere tossiche per le cellule vive o funzionare soltanto in cellule fissate. Un metodo senza marcatura per l’analisi delle conte cellulari e della confluenza cellulare permette ai ricercatori di monitorare in maniera quantitativa la proliferazione e la salute delle cellule senza dover ricorrere a flussi di lavoro laboriosi che potrebbero compromettere la vitalità cellulare.
La piattaforma per micropiastre multimodale SpectraMax i3/i3x con citometro per imaging MiniMax 300 utilizza l’esclusiva tecnologia di rilevazione cellulare StainFree con brevetto depositato per permettervi di eseguire saggi di proliferazione cellulare, di citotossicità e di altro tipo senza coloranti nucleari come il DAPI, che si intercala nel DNA, o coloranti per cellule vive, che a lungo termine sono in realtà tossici per le cellule.