Contatore di cellule

Al contatore di cellule: Cellule HEK293-GFP

Le cellule di rene embrionale umano 293, anche conosciute come HEK293, cellule 293 o semplicemente come cellule HEK, sono una linea cellulare derivata da rene embrionale umano. Sono state isolate nei primi anni 70’ del secolo scorso da Alex van der Eb nel suo laboratorio presso l’Università di Leiden, in Olanda; un altro membro dello stesso laboratorio le ha poi trasformate con un adenovirus, generando la linea cellulare attualmente in uso. Le cellule HEK293 sono facili da coltivare e trasfettare e pertanto sono state ampiamente utilizzate negli esperimenti basati sulla trasfezione, per studiare l’espressione proteica e nella produzione di vaccini. Abbiamo acquisito immagini di cellule HEK293 trasformate con un vettore lentivirale esprimente la proteina fluorescente verde (Green Fluorescent Protein, GFP; GenTarget Inc.) per mostrare l’analisi della confluenza cellulare sul citometro per imaging SpectraMax MiniMax 300.

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Figura 1: Identificazione delle cellule HEK293-GFP con la tecnologia StainFree

Identificazione delle cellule HEK293-GFP con la tecnologia StainFree

Immagini di cellule HEK293-GFP acquisite con il citometro per imaging SpectraMax i3 MiniMax 300. Le cellule sono state identificate utilizzando un’impostazione di analisi del campo personalizzata. A sinistra è mostrata l’immagine originale in luce trasmessa e a destra è visibile la stessa immagine con maschere viola che indicano le aree di confluenza identificate dal software.

Figura 2: Definizione delle aree occupate da cellule e delle aree di background

Definizione delle aree occupate da cellule e delle aree di background

Uso degli strumenti di disegno del software SoftMax Pro per definire le aree delle immagini occupate da cellule (giallo) e quelle di background (blu).

Figura 3: Immagini delle cellule HEK293-GFP acquisite con il citometro MiniMax

Immagini delle cellule HEK293-GFP acquisite con il citometro MiniMax

Cellule HEK293-GFP seminate a una densità di 20000, 5000 e 1250 cellule per pozzetto e visualizzate nel canale per la fluorescenza verde del citometro MiniMax.

Figura 4: Analisi StainFree e analisi in fluorescenza

Analisi StainFree e analisi in fluorescenza

Confronto tra le aree di confluenza misurate mediante analisi StainFree (cerchietti blu) e analisi in fluorescenza (cerchietti verdi). La percentuale di confluenza determinata con la tecnologia StainFree coincide quasi perfettamente con quella ottenuta mediante l’analisi in fluorescenza.

Suggerimento 1:

Talvolta le cellule sono troppo ammassate per poter essere contate individualmente. In questi casi, è possibile utilizzare l’impostazione di analisi del campo del software SoftMax Pro per identificare le aree coperte da cellule ovvero la percentuale di confluenza. È possibile utilizzare l’analisi StainFree per le cellule visualizzate nel canale in luce trasmessa. Per alcuni tipi cellulari, un’impostazione “Cells” predefinita nel software permetterà di identificare le aree coperte da cellule in maniera precisa e automatica. Per le cellule HEK293, quest’impostazione predefinita funziona abbastanza bene e può essere utilizzata per ottenere una stima della confluenza ai fini del controllo di qualità.

Suggerimento 2:

Se sono necessarie stime un po’ più precise della confluenza, la soluzione migliore potrebbe essere un’impostazione personalizzata definita dall’utente. Un metodo per ottenere misurazioni accurate della confluenza cellulare è quello di utilizzare lo strumento Background per tracciare alcune aree situate molto vicino ai bordi delle aree di confluenza, ma all’esterno di essi. In tal modo, è possibile ridurre al minimo la superficie adiacente alle cellule che viene contata come area coperta da cellule.

Kit di strumenti per l’analisi delle cellule HEK293-GFP

Impostazione dello strumento

Parametro
Impostazione per le conte cellulari
Configurazione ottica
Citometro per imaging SpectraMax MiniMax 300
Modalità di lettura
Imaging
Tipo di lettura
Punto terminale
Impostazioni della lunghezza d’onda
Luce trasmessa (TL), 541
Impostazioni per l’acquisizione delle immagini
Esposizione: 7 ms (TL), 20 ms (541)
Impostazioni per l’analisi delle immagini

Tipo di analisi: analisi del campo

Lunghezza d’onda per l’identificazione delle aree di confluenza: TL o 541

Identificazione degli oggetti
Impostazioni: impostazione personalizzata (Create New Setting [Crea nuova impostazione])

Informazione sulla tecnologia di rilevazione cellulare StainFree

Solitamente, i saggi di imaging basati su cellule richiedono l’uso di sonde fluorescenti che possono essere tossiche per le cellule vive o funzionare soltanto in cellule fissate. Un metodo senza marcatura per l’analisi delle conte cellulari e della confluenza cellulare permette ai ricercatori di monitorare in maniera quantitativa la proliferazione e la salute delle cellule senza dover ricorrere a flussi di lavoro laboriosi che potrebbero compromettere la vitalità cellulare.

La piattaforma per micropiastre multimodale SpectraMax i3 con citometro per imaging MiniMax 300 utilizza l’esclusiva tecnologia di rilevazione cellulare StainFree con brevetto depositato per permettervi di eseguire saggi di proliferazione cellulare, di citotossicità e di altro tipo senza coloranti nucleari come il DAPI, che si intercala nel DNA, o coloranti per cellule vive, che a lungo termine sono in realtà tossici per le cellule.