Contatore di cellule
Al contatore di cellule: Cellule NIH3T3
Isolata nel 1963 dagli scienziati George Todardo e Howard Green, la linea cellulare NIH3T3 deriva da fibroblasti embrionali di topo. Il nome di queste cellule spontaneamente immortalizzate proviene dal loro protocollo di coltura: “trasferimento di 3 giorni, inoculo di 3x105 cellule”. Attualmente rappresentano la linea cellulare di fibroblasti standard e sono note per la loro elevata efficienza di trasfezione e come modelli per esperimenti sulla pluripotenza indotta delle cellule staminali. Inoltre, sono utili come cellule nutrici nella ricerca sulle cellule staminali embrionali umane e vengono spesso utilizzate per coltivare cheratinociti poiché la crescita di queste cellule è favorita dai fattori di crescita prodotti dalle cellule NIH3T3.
La struttura allungata e le dimensioni variabili delle cellule NIH3T3 possono creare difficoltà per l’analisi delle immagini. Tuttavia, la tecnologia StainFree permette di contare con grande precisione queste cellule dalla forma irregolare.
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Figura 1. Analisi delle cellule NIH3T3 con la tecnologia StainFree
Immagini di cellule NIH3T3 acquisite con il citometro per imaging SpectraMax MiniMax 300. Le cellule sono state identificate utilizzando l’impostazione di analisi predefinita “CellsB”. A sinistra è mostrata l’immagine originale in luce trasmessa e a destra è visibile la stessa immagine con maschere viola che indicano le cellule identificate dal software.
Figura 2: Conte cellulari delle cellule NIH3T3
Le cellule NIH3T3 sono state seminate con una serie di diluizioni 1:2 in una piastra a 96 pozzetti. Le cellule sono state fissate e colorate con un colorante nucleare. Dopo la colorazione è stato utilizzato il citometro per imaging SpectraMax MiniMax 300 per contare le cellule utilizzando come base per la loro identificazione la colorazione nucleare rossa (curva rossa) o la tecnologia di rilevazione cellulare StainFree™ (curva blu). I due metodi di conteggio forniscono risultati quasi identici ed entrambe le curve presentano un valore r2 > 0,99.
Figura 3. Cellule NIH3T3 colorate
Cellule NIH3T3 colorate con falloidina marcata con AlexaFluor 488 e colorante nucleare rosso. Le immagini delle cellule sono state acquisite con il citometro per imaging SpectraMax MiniMax 300.
Suggerimento:
Per molte colture di NIH3T3, è possibile contare facilmente le cellule utilizzando una delle impostazioni predefinite del software SoftMax Pro. Può essere utilizzata l’impostazione “CellsB” o “CellsD”. In alternativa, potete utilizzare gli strumenti di disegno per creare una nuova impostazione personalizzata adatta per le vostre cellule specifiche. Per evitare i problemi creati dalla forma irregolare delle cellule e dalla loro tendenza a formare agglomerati, è possibile tracciare i contorni di una cellula di interesse leggermente all’interno dei bordi. Per evitare il rischio di sovrastimare il numero di cellule a causa dei loro lunghi processi, è sufficiente disegnare sui processi con lo strumento per il background per evitare che vengano contati come cellule separate.
Kit di strumenti per l’analisi delle cellule NIH3T3
- Piattaforma di rilevazione per micropiastre multimodale SpectraMax® i3
- Citometro per imaging SpectraMax® MiniMax™ 300
- Software SoftMax® Pro
Impostazione dello strumento
Informazione sulla tecnologia di rilevazione cellulare StainFree
Solitamente, i saggi di imaging basati su cellule richiedono l’uso di sonde fluorescenti che possono essere tossiche per le cellule vive o funzionare soltanto in cellule fissate. Un metodo senza marcatura per l’analisi delle conte cellulari e della confluenza cellulare permette ai ricercatori di monitorare in maniera quantitativa la proliferazione e la salute delle cellule senza dover ricorrere a flussi di lavoro laboriosi che potrebbero compromettere la vitalità cellulare.
La piattaforma per micropiastre multimodale SpectraMax i3 con citometro per imaging MiniMax 300 utilizza l’esclusiva tecnologia di rilevazione cellulare StainFree con brevetto depositato per permettervi di eseguire saggi di proliferazione cellulare, di citotossicità e di altro tipo senza coloranti nucleari come il DAPI, che si intercala nel DNA, o coloranti per cellule vive, che a lungo termine sono in realtà tossici per le cellule.