Contatore di cellule

Al contatore di cellule: Cellule THP-1

Derivata oltre 40 anni fa dal sangue di un paziente affetto da leucemia monocitica acuta, la linea cellulare monocitica umana THP-1 è ampiamente utilizzata per studiare la funzione di monociti e macrofagi, oltre che per la ricerca sulla leucemia. Solitamente le cellule THP-1 crescono in sospensione, ma possono anche essere indotte a differenziarsi in cellule aderenti simili a macrofagi che esprimono IL-8 e altri marcatori e possono quindi essere adoperate come sistema modello per il differenziamento.

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Figura 1: conte di cellule THP-1 indifferenziate con la tecnologia StainFree e con colorante nucleare fluorescente

Cellule THP-1 seminate a densità comprese tra 156 e 20.000 cellule per pozzetto sono state contate il giorno dopo la semina utilizzando la tecnologia StainFree (cerchietti blu) oppure sono stati contati i loro nuclei dopo colorazione con il colorante EarlyTox Live Red Dye (cerchietti rossi). Le differenze tra le conte cellulari ottenute con questi due metodi sono risultate inferiori o uguali al 5% a tutte le densità cellulari.

Figura 2: immagini di cellule THP-1 indifferenziate acquisite con il citometro MiniMax

A, Cellule THP-1 colorate con il colorante EarlyTox Live Red Dye. B, Maschere viola per l’identificazione di oggetti che mostrano le cellule rilevate dal software SoftMax Pro nel canale di imaging per la fluorescenza rossa. C, Immagini delle cellule acquisite nel canale TL. D, Cellule identificate mediante analisi StainFree nel canale TL.

Figura 3: Andamento temporale del differenziamento delle cellule THP-1

Le cellule THP-1 sono state seminate a una densità di 20.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a parete nera e a fondo trasparente. Sono state trattate con 25 ng/µl di PMA o con DMSO come controllo. Le immagini delle cellule sono state acquisite il giorno 0, il giorno 1 dopo l’aggiunta e il giorno 2 dopo l’aggiunta. La freccia gialla indica una cellula differenziata con morfologia appiattita aderente.

Figura 4: Proliferazione delle cellule THP-1

La proliferazione cellulare è stata misurata in cellule trattate con PMA o in cellule di controllo trattate con DMSO utilizzando la tecnologia StainFree. Il trattamento con PMA arresta la proliferazione cellulare, mentre le cellule di controllo continuano a dividersi.

Figura 5: Saggio ELISA per IL-8

Concentrazione di IL-8 misurata tramite ELISA in cellule THP-1 trattate con PMA e con DMSO. Le cellule sono state seminate a una densità di 24.000 cellule per pozzetto e i sopranatanti sono stati raccolti per il saggio 48 ore dopo l’inizio del trattamento. Il saggio ELISA per l’IL-8 basato sull’assorbanza è stato rilevato mediante il lettore per micropiastre SpectraMax i3.

Suggerimento:

Per le cellule in sospensione, come le cellule THP-1 indifferenziate, è possibile utilizzare un tempo di esposizione più basso per minimizzare la perdita del fuoco causata dal movimento fluttuante delle cellule. Il citometro per imaging SpectraMax MiniMax 300 permette di passare molto rapidamente da una lunghezza d’onda all’altra, minimizzando l’entità del movimento delle cellule che si può verificare tra le immagini, per cui è possibile ottenere migliori sovrapposizioni delle immagini acquisite in canali diversi. L’impostazione predefinita di analisi delle immagini in TL “CellsC” funziona bene per le cellule in sospensione con morfologia arrotondata, mentre l’impostazione “CellsA” permette di identificare più accuratamente le cellule differenziate più appiattite.

Kit di strumenti per l’analisi delle cellule THP-1

Impostazioni dello strumento per l’imaging e la conta cellulare

Parametro
Cellule THP-1 indifferenziate
Cellule THP-1 differenziate
Configurazione ottica
Citometro per imaging SpectraMax MiniMax 300
Modalità di lettura
Imaging
Tipo di lettura
Punto terminale
Impostazioni della lunghezza d’onda
Luce trasmessa, 713
Impostazioni per l’acquisizione delle immagini
Esposizione: 2 ms (TL), 17 ms (713)
Esposizione: 6 ms (TL)
Impostazioni per l’analisi delle immagini

Tipo di analisi: Analisi di oggetti distinti

Lunghezza d’onda per l’identificazione di oggetti: TL o 713

Identificazione degli oggetti
Impostazione predefinita: CellsC
Impostazione predefinita: CellsA

Informazione sulla tecnologia di rilevazione cellulare StainFree

Solitamente, i saggi di imaging basati su cellule richiedono l’uso di sonde fluorescenti che possono essere tossiche per le cellule vive o funzionare soltanto in cellule fissate. Un metodo senza marcatura per l’analisi delle conte cellulari e della confluenza cellulare permette ai ricercatori di monitorare in maniera quantitativa la proliferazione e la salute delle cellule senza dover ricorrere a flussi di lavoro laboriosi che potrebbero compromettere la vitalità cellulare.

La piattaforma per micropiastre multimodale SpectraMax i3 con citometro per imaging MiniMax 300 utilizza l’esclusiva tecnologia di rilevazione cellulare StainFree con brevetto depositato per permettervi di eseguire saggi di proliferazione cellulare, di citotossicità e di altro tipo senza coloranti nucleari come il DAPI, che si intercala nel DNA, o coloranti per cellule vive, che a lungo termine sono in realtà tossici per le cellule.