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Cell Painting

Un saggio ad alto contenuto basato su immagini per la profilazione morfologica che utilizza coloranti fluorescenti multiplex

Cos’è il Cell Painting?

Il Cell Painting è un saggio multiplex ad alto contenuto basato su immagini, utilizzato per la profilazione citologica. In un saggio di Cell Painting vengono utilizzati fino a sei coloranti fluorescenti per marcare diversi componenti della cellula, tra cui il nucleo, il reticolo endoplasmatico, i mitocondri, il citoscheletro, l’apparato di Golgi e l’RNA. L’obiettivo è quello di “colorare” la cellula quanto più possibile per acquisirne un’immagine rappresentativa nella sua interezza.

Viene utilizzato un software di analisi automatizzata delle immagini per eseguire misurazioni degli aspetti caratteristici di ciascuna cellula. Il numero di singole misurazioni varia generalmente da 100 a 1000 per cellula. Queste misurazioni solitamente riguardano l’intensità, la consistenza, la forma, le dimensioni e la prossimità di un oggetto alla sua struttura circostante, informazioni che forniscono indicazioni in merito alle relazioni spaziali tra gli organelli. Nell’insieme, queste misurazioni generano il profilo fenotipico.

Colorante nucleare

Nucleo
Colorante: Hoechst 33342

MitoTracker Deep Red

Mitocondri
Colorante: MitoTracker Deep Red

Colorante per il reticolo endoplasmatico

Reticolo endoplasmatico
Colorante: Coniugato concanavalina A/Alexa Fluor 488

Colorante per nucleoli, RNA citoplasmatico

Nucleoli, RNA citoplasmatico
Colorante: Colorante fluorescente verde per gli acidi nucleici SYT0 14

Colorante per actina F del citoscheletro, Golgi, membrana plasmatica

Actina F del citoscheletro, Golgi, membrana plasmatica
Colorante: Coniugato falloidina/Alexa Fluor 568, coniugato agglutinina di germe di grano/Alexa Fluor 555
 

Reticolo endoplasmatico (ER) e nuclei

Immagine composita in cui sono visualizzati l’actina, il reticolo endoplasmatico (Endoplasmic Reticulum, ER) e i nuclei.

 

Il Cell Painting per la profilazione fenotipica

 

Il profilo fenotipico di una cellula ne rivela lo specifico stato biologico. Più specificamente, può essere utilizzato per esaminare le alterazioni biologiche, perché la morfologia cellulare è influenzata da fattori quali il metabolismo, lo stato genetico ed epigenetico della cellula e i segnali ambientali. Inoltre, può essere utilizzato per caratterizzare le cellule sane rispetto a quelle malate. Poiché un profilo fenotipico è una combinazione di un elevato numero di misurazioni, è più sensibile alle deviazioni o alle variazioni delle caratteristiche ricavate attraverso il saggio di Cell Painting. In altre parole, un profilo fenotipico permette di cogliere determinate caratteristiche delle cellule che potrebbero non essere evidenti ad occhio nudo.

In un’intervista con il sito the Science Explorer, Angeline Lim, PhD., ha spiegato: “Mi piace pensare al Cell Painting o alla profilazione fenotipica come un analogo del riconoscimento facciale. È un po’ come i tag che vengono aggiunti alle persone su Facebook o in iPhoto. Quando una fotografia viene taggata, il software in background estrae le informazioni che la riguardano e calcola un profilo. Quando viene visualizzata un’altra fotografia, il software confronta il suo profilo con quello della fotografia precedente per vedere se sono gli stessi o sono diversi. Sostanzialmente è così che funziona il Cell Painting. Con il Cell Painting, ci aspettiamo che la parte di analisi delle immagini raggruppi le cellule permettendo di distinguere quelle simili da quelle diverse o quelle malate da quelle sane. Potenzialmente, questo approccio ha numerose applicazioni, specialmente nel campo della scoperta farmacologica.”

 

Esempi di cellule trattate e alterazioni fenotipiche

 

Qui è riportato un esempio in cui le cellule trattate presentano alterazioni evidenti del loro fenotipo; in queste immagini composite sono mostrate soltanto tre delle cinque lunghezze d’onda: nuclei in blu, reticolo endoplasmatico in verde, actina e Golgi in rosso.

 

Controllo, cellule non trattate

Controllo, cellule non trattate.

Cellule trattate con rotenone

Cellule trattate con rotenone, una tossina frequentemente usata negli insetticidi. Inoltre, è noto che inibisce la produzione mitocondriale di ATP ed è stato dimostrato che possiede attività antineoplastica in varie cellule tumorali.

Cellule trattate con clorochina

Cellule trattate con clorochina. La clorochina è stata inizialmente sviluppata per il trattamento della malaria.

 

Flusso di lavoro generale per il saggio di Cell Painting

 

Uno dei vantaggi offerti dal saggio di Cell Painting è che molti biologi hanno dimestichezza con il flusso di lavoro generale utilizzato. Innanzitutto, è necessario seminare le cellule. Quindi, occorre introdurre una perturbazione, che può essere di tipo chimico o genetico (ad es. aggiunta di composti, di piccole molecole o di una libreria di RNAi). Dopo un opportuno periodo di incubazione, le cellule vengono colorate con un set di coloranti per Cell Painting. È anche possibile utilizzare altre combinazioni di coloranti che siano più adatte allo specifico saggio in corso.

Una volta che le cellule sono state colorate, le immagini vengono acquisite con un imager ad alto contenuto come la nostra piattaforma ImageXpress® Confocal HT.ai, l’ultima novità della nostra gamma di sistemi di imaging ad alto contenuto. Viene poi utilizzato un software automatizzato di analisi delle immagini come il nostro MetaXpress® o il nostro software di analisi delle immagini IN Carta per l’estrazione delle caratteristiche, un processo nel quale le cellule e i loro componenti vengono identificati e misurati. Infine, le misurazioni vengono ulteriormente elaborate mediante vari strumenti di analisi dei dati per creare e confrontare profili fenotipici, eseguire analisi di clustering e identificare target allo scopo di ricavare profili morfologici.

 

Flusso di lavoro generale per il saggio di Cell Painting

 

  1. Seminare le cellule nel contenitore (piastra a 384 pozzetti)
  2. Trattare le cellule con sostanze chimiche, con tecniche che producono alterazioni genetiche (ad es. RNAi, CRISPR/Cas9) o con virus.
  3. Colorare le cellule con coloranti fluorescenti (ad es. Hoechst, falloidina, MitoTracker)
  4. Acquisire le immagini delle cellule con un sistema di imaging ad alto contenuto
  5. Analizzare le immagini delle cellule per ottenere caratteristiche e misurazioni utilizzando un software automatizzato di analisi delle immagini
  6. Ricavare profili morfologici dalle misurazioni

 


 

Scoprite di più sul Cell Painting

 

Con le sue numerose e importanti potenziali applicazioni, il Cell Painting si sta affermando come un utile strumento, in particolare nel campo della scoperta farmacologica. Scoprite come ottimizzare le funzionalità di imaging ad alto contenuto ed eseguire saggi multiplex utilizzando i moduli preconfigurati o personalizzati del software MetaXpress per ottenere un profilo fenotipico ricco di dati.

 

 

Risorse per il Cell Painting

Video e webinar

Rassegna delle innovazioni all’ISSCR 2021: Processi automatizzati di coltura e imaging ad alto contenuto di organoidi 3D polmonari e cardiaci

Come sfruttare le potenzialità dei saggi di Cell Painting

Come sfruttare le potenzialità dei saggi di Cell Painting