Il Dementia Research Institute dell’Università di Cardiff utilizza il sistema FLIPR Penta per studiare il ruolo della microglia nella malattia di Alzheimer

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“FLIPR Penta supera l’efficienza di un microscopio invertito, permettendomi di fotografare una quantità significativamente maggiore di cellule e campioni. In particolare, mi permette di acquisire un numero di campioni di circa 100 volte superiore al giorno.”

Dott.ssa Emily Maguire

AZIENDA/UNIVERSITÀ

Università di cardiff, Dementia Research Institute (Istituto di ricerca sulla demenza)

MEMBRI DEL TEAM

Dott.ssa Emily Maguire,

Dott.ssa Nina Stöberl,

Dott.ssa Hazel Hall-Roberts,

Dott.ssa Hazel Hall-Roberts,

Sig.ra Rachel O’Donoghue,

Sig.ra Jincy Winston

PRODOTTI UTILIZZATI

Sistema di screening cellulare ad alto rendimento FLIPR penta

Testina a 384 pozzetti per FLIPR Penta

Kit di saggio del calcio 6 FLIPR

La sfida

La dottoressa Emily Maguire e il suo team dell’UK Dementia Research Institute dell’Università di Cardiff mirano a identificare le cause della malattia di Alzheimer per migliorare l’assistenza, la diagnosi e, in ultima analisi, il trattamento dei pazienti.

La ricerca del gruppo di Emily è incentrata sull’identificazione delle differenze tra le cellule cerebrali di persone affette e non dalla malattia di Alzheimer. In particolare, stanno esaminando una classe particolare di cellule immunitarie cerebrali note come microglia, che sono emerse come fattori di fondamentale importanza nella progressione della malattia di Alzheimer. Utilizzano test genetici per stimare il rischio di Alzheimer e raccolgono campioni di sangue da due gruppi: soggetti a basso rischio e soggetti ad alto rischio già colpiti dalla malattia. Le cellule ematiche vengono trasformate in cellule staminali e poi differenziate in microglia. Questo approccio consente al team di confrontare le microglia di soggetti ad alto e basso rischio e di identificare le differenze legate alla malattia di Alzheimer. Questa ricerca permetterà ai ricercatori di sviluppare in futuro terapie specifiche per la malattia di Alzheimer.

La dottoressa Emily Maguire e il suo team
Un consistente numero di ricerche scientifiche precedenti documenta ampiamente il malfunzionamento della trasduzione del segnale del calcio nelle cellule colpite dalla malattia di Alzheimer. La Dott.ssa Maguire afferma che per questo motivo era importante confrontare i cambiamenti nella trasduzione del segnale del calcio nella microglia sana e affetta. In precedenza, la Dott.ssa Maguire aveva esaminato la trasduzione del segnale del calcio tra cellule con diversi livelli di rischio di demenza a livello di singola cellula, utilizzando un microscopio invertito. Sebbene questa tecnica abbia fornito dati di grande valore, si è rivelata complicata e lunga. Di conseguenza, di fronte alla difficoltà di esaminare la trasduzione del segnale del calcio in 60 linee cellulari, il FLIPR Penta ha offerto la soluzione ideale.

“Per fotografare un campione al microscopio invertito con lo stesso numero di ripetizioni del FLIPR Penta, sarebbero necessarie circa 3 ore di lavoro (più 1,5 ore per il caricamento del colorante del calcio). Tuttavia, con il FLIPR Penta, è possibile fotografare un numero di campioni 30 volte superiore in circa 30 minuti di lavoro (più il caricamento del colorante del calcio). Questo semplifica notevolmente il processo di ottenimento delle ripetizioni.”

– Dott.ssa Emily Maguire

La soluzione

La dottoressa Emily Maguire e il suo team

Il team ha utilizzato il FLIPR Penta per confrontare la risposta della microglia di pazienti ad alto rischio di Alzheimer con quella di pazienti a basso rischio di Alzheimer quando esposta a modulatori di calcio noti. Questi confronti miravano a identificare le discrepanze nella trasduzione del segnale del calcio tra le cellule affette e quelle non affette, facendo potenzialmente luce sulla patologia sottostante.

L’approccio prevedeva l’inserimento delle cellule in una piastra a 384 pozzetti e la loro colorazione con un colorante verde fluorescente Calcium 6 di Molecular Devices. Dopo l’incubazione, hanno caricato un composto specifico (ad esempio, ATP) in un’altra piastra. Entrambe le piastre sono state inserite nel FLIPR Penta, che ha aggiunto il composto alle cellule e ha registrato le variazioni di fluorescenza sia prima che nei 5 minuti successivi all’aggiunta del composto. Questo ha permesso al team di misurare il calcio rilasciato al momento dell’applicazione del composto e, quindi, il livello di trasduzione del segnale cellulare. Per standardizzare i risultati, il team ha anche acquisito un’immagine della piastra con le cellule e ha normalizzato le misure di fluorescenza in base al numero di cellule in ogni pozzetto, consentendo di ottenere confronti accurati e affidabili tra i pozzetti.

Il FLIPR Penta ci permette di analizzare un gran numero di campioni, fino a un massimo di 24 per esperimento in una piastra a 384 pozzetti, riducendo al minimo la variabilità derivante dalle fluttuazioni dei fattori esterni tra un esperimento e l’altro”. Inoltre, lo strumento FLIPR ci permette di somministrare contemporaneamente quantità precise di reagenti (in particolare ATP nel nostro caso) in ogni pozzetto, garantendo così l’uniformità in tutti i pozzetti e migliorando la coerenza delle nostre misurazioni.”

– Dott.ssa Emily Maguire

Il ricercatore impiega circa 2 ore per preparare una piastra per il saggio del calcio FLIPR, anche se gran parte di questo tempo è rappresentato dall’incubazione del colorante. L’effettivo imaging di una piastra richiede 10 minuti. Per questo motivo, scaglionando la colorazione con Calcium 6, sarebbe possibile acquisire più di 50 piastre al giorno.

Prodotti utilizzati

Sistema di screening cellulare ad alto rendimento FLIPR penta e kit per saggio FLIPR Calcium

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I risultati

Sebbene la ricerca non sia conclusiva, i risultati preliminari hanno mostrato una potenziale disparità nella trasduzione del segnale del calcio mediata dall’ATP tra i due gruppi.

“Conducendo ulteriori esperimenti utilizzando la tecnica FLIPR Penta con una gamma più ampia di linee cellulari derivate da pazienti, possiamo migliorare la solidità del nostro studio e potenzialmente ottenere risultati più conclusivi.”

– Dott.ssa Emily Maguire

L’osservazione di variazioni significative potrebbe indicare che la trasduzione del segnale ATP-calcio svolge un ruolo importante nella malattia di Alzheimer, aprendo potenzialmente nuove strade per lo sviluppo di terapie.

Il grafico mostra come ci sia stata una tendenza non significativa all’aumento del rilascio di calcio

A. Il grafico mostra una tendenza non significativa all’aumento del rilascio di calcio dopo l’aggiunta di ATP nella nostra microglia ad alto rischio di Alzheimer rispetto alle cellule a basso rischio. Questi dati sono stati raccolti con una serie preliminare di 9 linee di cellule staminali (6 ad alto rischio, 3 a basso rischio). I diversi colori indicano cellule provenienti da vari soggetti e le diverse forme indicano diverse repliche sperimentali.

B. Immagine di microscopia a fluorescenza di microglia colorata con il colorante Calcium 6.

Oltre all’ATP, il team ha identificato diversi altri mediatori all’interno delle cellule che svolgono un ruolo di fondamentale importanza nella mobilitazione del calcio. Nelle indagini future, quindi, si potranno esaminare gli effetti dell’introduzione di diverse molecole note per indurre il rilascio di calcio attraverso vari meccanismi, come altri nucleotidi come ADP e UDP che si legano a diversi recettori. Il concetto è che, confrontando le risposte della microglia ad alto e basso rischio di Alzheimer a questi attivatori alternativi, il team possa valutare se esistono distinzioni tra i due gruppi.

Per maggiori informazioni sull’UK Dementia Research Institute (Istituto di Ricerca sulla Demenza del Regno Unito) dell’Università di Cardiff, visitate il loro sito web.

Assaying Microglia Functions In Vitro | UK Dementia Research Institute

IPMAR: major new cellular model platform launched to transform understanding of risk factors for Alzheimer’s disease | UK Dementia Research Institute