Il team di Visikol sviluppa modelli di colture cellulari 3D per simulare il processo di progressione di malattie come la NASH e la NAFLD utilizzando il sistema di imaging ad alto contenuto ImageXpress Micro Confocal e il software MetaXpress

La sfida

Nel campo della steatoepatite non alcolica (Non-Alcoholic Steatohepatitis, NASH) e della steatosi epatica non alcolica (Nonalcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD) è emersa la forte necessità di un modello in vitro che permetta ai ricercatori di eseguire uno screening più efficace dei potenziali composti terapeutici durante saggi in vitro più economici e a rendimento medio. Le malattie epatiche colpiscono milioni di persone ogni anno negli Stati Uniti; ciononostante, esistono pochi trattamenti terapeutici efficaci. Visikol è impegnata a cambiare il paradigma in base al quale vengono analizzati tessuti e cellule da un approccio qualitativo guidato dall’uomo a un approccio quantitativo guidato da una visione computerizzata. L’azienda offre servizi a clienti del settore farmaceutico e biotecnologico per aiutarli ad accelerare le loro attività di scoperta farmacologica e a ridurre il divario traslazionale esistente tra studi in vitro e in vivo attraverso l’uso di avanzati modelli di coltura cellulare e tecniche di analisi.

È noto che gli stadi precoci della NASH e della NAFLD sono reversibili, ma i ricercatori hanno avuto problemi a sviluppare trattamenti in grado di invertire questi processi. Una delle principali difficoltà nello sviluppo di questi trattamenti è che non esistono modelli in vitro predittivi in grado di riprodurre accuratamente il tessuto epatico e la progressione patologica della NASH o della NAFLD in vitro. A causa di questa mancanza di modelli in vitro, molte sperimentazioni cliniche in fase avanzata non hanno avuto successo e il costo e il tempo necessari per sviluppare questi trattamenti sono stati significativi.

Inoltre, l’imaging di modelli di coltura cellulare 3D è complesso, poiché il materiale biologico disperde la luce in maniera efficace e la qualità delle immagini si deteriora rapidamente in campioni più spessi. Per di più, può essere difficile ottenere una marcatura uniforme dei tessuti 3D mediante l’elaborazione di set di dati tridimensionali.

La soluzione

Per l’imaging, Visikol ha utilizzato il sistema di imaging ad alto contenuto ImageXpress® Micro Confocal che permette ai ricercatori di visualizzare integralmente modelli di coltura cellulare 3D, o sferoidi, nella loro interezza, quando combinato con la tecnica Visikol® HISTO-M^™. Il software di acquisizione e analisi delle immagini ad alto contenuto MetaXpress® ha fornito una rappresentazione di ciascun pozzetto della piastra (ciascun pozzetto con uno sferoide). Il team di Visikol ha selezionato la lunghezza d’onda corretta per la luce di eccitazione dei fluorofori nel modello, che ha emesso una lunghezza d’onda di luce diversa che è stata acquisita dalla videocamera dell’imager. In seguito è stata eseguita la definizione manuale della soglia, che ha permesso di identificare le regioni di collagene positive per la colorazione. Solitamente, l’imaging viene realizzato con 20 sezioni Z, una procedura che permette alla videocamera di acquisire l’intero range dello sferoide, che in media presenta uno spessore di 150-250 micron. La compressione delle sezioni Z utilizzando l’emissione a massima intensità di ciascuna sezione ha permesso di creare lo Z-stack, che era costituito da una compilazione delle emissioni più luminose di ciascuna sezione in una singola immagine. Le immagini ottenute hanno permesso la visualizzazione delle immunocolorazioni, tra cui albumina, vimentina, CD68, CD31 e DAPI, in vari canali.

L’imaging dei modelli ha permesso ai ricercatori di visualizzare in che modo i composti interagiscono con le cellule, offrendo loro la possibilità di capire come può influire un composto sui soggetti che partecipano alle sperimentazioni cliniche. L’aspetto importante dei modelli 3D di NASH è l’analisi del tessuto cicatriziale che si forma nel modello. L’imaging può anche rivelare la vitalità delle cellule nel modello in relazione ai composti utilizzati dal cliente.

Software di acquisizione e analisi delle immagini ad alto contenuto MetaXpress

Dettagli

Sistema di imaging ad alto contenuto ImageXpress Micro Confocal

Dettagli

Prodotti utilizzati

Il sistema ImageXpress Micro Confocal è una soluzione ad alto contenuto che consente il passaggio dall’imaging in campo largo a quello confocale per l’analisi di cellule vive e fissate. Permette di acquisire immagini di alta qualità di interi organismi, tessuti spessi, modelli 2D e 3D ed eventi cellulari o intracellulari. La tecnologia confocale a disco rotante e la videocamera sCMOS consentono l’imaging di eventi rapidi e rari come il battito delle cellule cardiache e il differenziamento delle cellule staminali. Con il software MetaXpress, il sistema permette di eseguire numerose applicazioni di imaging confocale che vanno dallo sviluppo di saggi 3D agli screening.

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I risultati

Il team di Visikol ha sviluppato vari modelli di coltura cellulare 3D che riproducono il microambiente tissutale presente nel fegato per simulare il processo di progressione patologica della NASH e della NAFLD. Questi modelli vengono valutati utilizzando l’imaging confocale 3D ad alto contenuto, combinato con altre letture e vari trattamenti terapeutici per quantificare in che misura questi migliorano il processo di fibrosi associato alla NASH.

Sferoidi 3D di co-colture di cellule HepaRG Visikol e cellule non parenchimali sono stati pretrattati con il veicolo o con un inibitore di ALK-5 per 1 ora prima di indurre fibrosi con TGF-β 100 nM per 48 ore. Nelle immagini qui sopra, il DAPI appare in blu, l’indicatore della vitalità in verde e vari tipi di collagene in rosso. Il volume e l’intensità della fluorescenza di vari tipi di collagene sono stati quantificati per ciascun modello di coltura cellulare 3D come descritto di seguito. È possibile vedere che il TGF-β riduce la vitalità cellulare e le dimensioni dello sferoide, oltre a indurre la deposizione di collagene, mentre l’inibitore di ALK-5 è in grado di migliorare parzialmente sia la riduzione della vitalità cellulare che la deposizione di collagene.