Organoidi 3D e automazione di saggi cellulari complessi [Podcast]
Mentre entriamo nell’era della ricerca di nuovi farmaci con la terapia genica e la medicina personalizzata, abbiamo bisogno di essere pronti a studiare le malattie complesse, valutare l’effetto terapeutico dei farmaci e identificare gli effetti negativi che possono rappresentare un rischio per la salute del paziente. Sfortunatamente, gli attuali metodi preclinici, come i modelli animali o le coltivazioni di cellule 2D, sono inadeguati. Dal momento che le proprietà fisiche e chimiche di questi modelli non rappresentano la condizione umana, la valutazione pre-clinica del farmaco non si traduce in successo clinico. Ecco perché lo sviluppo di modelli di cellule 3D, come gli organoidi, può essere una pietra miliare enorme per migliorare la valutazione dell’efficacia e della sicurezza dei farmaci.
La dottoressa Oksana Sirenko è la direttrice dello sviluppo di test presso la divisione Dispositivi Molecolari, lavorando allo sviluppo di modelli basati su cellule complesse per la biologia 3D, nonché per l’imaging ad alto contenuto e l’automazione dei test.
In questo estratto di podcast, lo scienziato anziano Oksana illustra i vantaggi dei modelli di celle 3D, affrontando al contempo le difficoltà nell’imaging cellulare 3D, come la qualità dell’immagine, l’alta rendimento, l’automazione e l’analisi.
Sommario
1. Perché i modelli di cellule 3D e gli organoidi 3D sono così utili nella ricerca sulle malattie e nello screening dei farmaci?
Il problema principale nell’attuale ricerca sulle malattie e nello sviluppo di farmaci è che solo circa il 3% dei farmaci sviluppati arriva alla clinica. La maggior parte dei farmaci fallisce nelle sperimentazioni cliniche a causa della mancanza di efficacia o di problemi di tossicità indesiderati. Sono necessari sistemi di test e modelli di malattia migliori per facilitare la ricerca di farmaci e predire meglio il successo in clinica.
Oggi, la biologia si sta spostando verso una maggiore complessità per i test e i modelli che possono essere utilizzati per la ricerca e lo sviluppo di farmaci. Si ritiene che i modelli 3D colmino il divario tra i modelli tradizionali basati su cellule e i tessuti e gli organi. I modelli 3D, che includono sferoidi, organoidi e organo su chip, presentano una varietà di tipi di cellule umane, come il fegato, le cellule immunitarie, le cellule cardiache e i fibroblasti. Inoltre, possono imitare la morfologia dei tipi di tessuto umano, come la crescita del tumore 3D, le cripte negli organoidi intestinali, i tubi neurali o il flusso di liquidi. Infine, rappresentano almeno alcuni aspetti della funzionalità dei tessuti, dall’attività metabolica del fegato alla battuta degli organoidi cardiaci, fino ai picchi di attività neuronale negli organoidi del cervello. Questa maggiore complessità e sofisticazione ci consentono di imitare i processi nei tessuti, le interazioni tra i tipi di cellule, le risposte ai farmaci, gli effetti di sfissicità e i processi di penetrazione dei farmaci nel tessuto.
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Gli organoidi cerebrali mostrano un’organizzazione che ricorda un cervello in via di sviluppo.
2. Perché la complessità dei modelli 3D presenta un ostacolo/una difficoltà per i ricercatori?
I tradizionali test di celle 2D sono più facili da lavorare, ma i test 3D hanno una maggiore predicibilità e consentono la generazione di dati più rilevanti dal punto di vista biologico. Tuttavia, malgrado l’aumento dell’interesse nella ricerca 3D, l’ampia adozione dei test è limitata dagli ostacoli tecnici e dalla complessità dei test, il che comporta costi più elevati, una minore rendimento e una mancanza di riproducibilità. Una maggiore complessità presenta delle difficoltà, ma le opportunità per lo sviluppo di strumenti e lo sviluppo di automazione consentono agli esperti di eseguire dei test 3D con maggiore rendimento e precisione.
3. È possibile definire un tipico flusso di lavoro per lo sviluppo e l’analisi di organoidi 3D?
Il tipico flusso di lavoro per i test degli organoidi contiene una serie di passi, e questo processo è in genere molto più lungo dei passi del flusso di lavoro 2D.
Gli organoidi 3D possono essere derivati da cellule primarie come gli organoidi intestinali o le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), per esempio gli organoidi neuronali o cardiaci. Il flusso di lavoro può iniziare dalla pre-coltura o espansione 2D delle cellule iPSC, seguita dalla fase di differenziazione. Dopodiché, le cellule vengono miscelate con Matrigel e in genere si sviluppano all’interno delle cupole Matrigel, che possono anche includere il passaggio e l’espansione. Gli organoidi intestinoli, colorettale, pancreatico e epatico sono in genere sviluppati utilizzando questo gradino della cupola Matrigel.
In alternativa, alcuni altri tipi di organoidi non richiedono Matrigel, ma sono invece sviluppati in piastre a basso attaccamento (ad es., organoidi cardiaci).
Lo sviluppo di organoidi richiede da pochi giorni a diverse settimane. Alcuni protocolli richiedono anche alcuni mesi. Questo è un processo molto noioso e trarrà grandi benefici dall'automazione.
Infine, il test dell’Endpoint, che si tratti di un trattamento farmacologico, di un test di infettività virale o di una valutazione della tossicità, è impostato in un formato a più pozzi, con 96 o piastre 384a pozzo.
Successivamente, le cellule vengono trattate con dei farmaci e processate per la lettura, che possono includere test ATP, test di morte cellulare, imaging ad alto contenuto o oscillazione del calcio.
4. Può dirmi un po’ di come applica i flussi di lavoro dei modelli di celle 3D specificamente alla sua ricerca?
Ci stiamo concentrando sullo sviluppo di protocolli di automazione per le coltivazioni di cellule automatiche, nonché sull’imaging automatico e l’analisi delle immagini per complessi flussi di lavoro 3D. Di recente, abbiamo sviluppato ed eseguito test di screening automatici per trovare dei farmaci anti-cancro più efficienti per il carcinoma della seno triplo negativo. Abbiamo utilizzato organoidi di tipo oncologico derivati dal paziente che rappresentano un gene di fenotipo di malattia resistente ai farmaci, e abbiamo applicato l’automazione alla coltivazione di organoidi 3D, simulato l’intervento di un farmaco ed eseguito test end-point per identificare i composti che uccidono le cellule tumorali. Abbiamo testato una libreria di composti e trovato diversi candidati che avevano maggiore efficacia rispetto agli attuali farmaci standard.
5. È possibile spiegare come si rende più sicuro il flusso di lavoro per lo sviluppo e l’analisi degli organoidi?
Abbiamo creato una cella di lavoro automatica presso la divisione Dispositivi Molecolari che riunisce diversi strumenti in un sistema complesso. Include un sistema di movimentazione dei liquidi automatico Beckman Biomek, un’incubatrice automatica LiCONiC, il nostro sistema di imaging ad alto contenuto ImageXpress HT.ai, il nostro lettore di piastre SpectraMax e la lavavetrina AquaMaxe una centrifuga automatica Bionex. Tutti i componenti sono collegati da un robot collaborativo, PreciseFlex, 400 in grado di spostare le piastre da uno strumento a un altro nei punti temporali desiderati, mentre il software di programmazione garantisce che tutti gli elementi del sistema funzionino insieme senza problemi. Ogni strumento dispone di più protocolli progettati per diversi passaggi, tra cui l’avanzamento delle cellule e la piastratura degli organoidi, che può essere richiamata dal pianificatore in momenti indicati.
Il nuovo Centro di innovazione sugli organoidi di Molecular Devices combina tecnologie all’avanguardia con nuovi metodi per la biologia 3D per affrontare le problematiche associate alla scalabilità dei sistemi biologici 3D complessi.
I metodi di diagnostica per immagini sono un’altra area entusiasmante della tecnologia per la ricerca sugli organoidi. Per acquisire immagini di organoidi o organo su chip, è necessario utilizzare un’ottica avanzata. Il sistema di imaging ad alto contenuto ImageXpress presenta diversi vantaggi per i campioni 3D:
Potenti laser e ottica confocale ci consentono di prendere lo Z-stack di più immagini a partire dal basso e andando verso l'alto con passi come 5-10 micron L'ottica confocale ci consente di scartare la luce che è fuori fuoco in modo da poter ottenere immagini più nitide attraverso gli organoidi e Matrigel.
Successivamente, il nostro software di analisi delle immagini MetaXpress analizza le immagini in ogni slice 2D e converte i dati in spazio 3D. Si possono ottenere più misurazioni per caratterizzare organoidi, cellule o organoidi subcellulari. Queste misurazioni aiutano a definire le conte, le intensità, i volumi, l’area, le distanze e altro ancora, consentendoci di monitorare e quantificare le variazioni nella morfologia, nel contenuto cellulare e nella vitalità. Disponiamo anche di elementi di macchina, in cui gli utenti possono addestrare il software per riconoscere gli oggetti e le funzioni, per fornire un'analisi più efficiente e approfondita.
6. In che modo l'automazione può aiutare nella ricerca di sistemi complessi in particolare?
L'automazione ridurrebbe il lavoro e le attività ripetitive come l'alimentazione delle cellule ogni giorno o ogni due giorni per 2 mesi. Inoltre, aiuterà ad aumentare la ricerca con una maggiore rendimento. Ad esempio, invece di esaminare linee 3 cellulari o 5 mutazioni, l’automazione consente di testare le linee 50 cellulari per esaminare le 100 mutazioni.
L’imaging ad alto contenuto basato su algoritmi di macchina consentirà di osservare e caratterizzare una serie di cambiamenti negli organoidi e nelle cellule, fornendo letture multiple e producendo una serie di informazioni preziose sulla crescita cellulare, sulla differenziazione, sul ciclo cellulare, sulla morte, sull’apoptosi, sull’espressione genica o sull’attivazione di vie di segnalazione.
7. Come userete di nuovo questi sistemi nella vostra ricerca futura?
Oltre agli studi sulla biologia del cancro, stiamo lavorando per sviluppare altri flussi di lavoro, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, gli organoidi intestinali, il flusso di lavoro delle cellule staminali, gli organoidi cardiaci e altro ancora.
8. Come si evolverà in futuro l’automazione dell’analisi degli organoidi 3D?
Siamo dell’avviso che, con l’evolversi della biologia e l’aumento della complessità dei test, l’automazione sarà sempre più importante per una migliore comprensione dei meccanismi delle malattie, per accelerare la ricerca di nuovi farmaci e infine per trovare modi migliori per curare le malattie.
Con lo sviluppo di nuove e più avanzate tecnologie e strumenti, siamo dell’avviso che contribuiremo ulteriormente al progresso delle scienze della vita.
Comprendere i principi di base alla base degli organoidi 3D - e gli attuali colli di bottiglia - è fondamentale per lo sviluppo e l’utilizzo di successo di questi modelli avanzati per la ricerca farmacologica.
Ascoltare l’intero podcast
Se desideri saperne di più, goditi il podcast completo “Test complessi con Ian Shoemaker, Beckman Coulter Life Sciences e la Dott.ssa Oksana Sirenko, Molecular Device”.
Recensione del target del farmaco · Episodio 14 - Ian ShoeMaker, Beckman Coulter e Dr Oksana Sirenko, Dispositivi Molecolari
Qui discutono di una panoramica completa sulla tecnologia della ricerca sugli organoidi: scopri come vengono sviluppati i modelli di organoidi, utilizzati nella ricerca dei nostri esperti e come l'automazione dell'analisi 3D degli organoidi si evolverà in futuro, e molto altro!