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Fluorescenza

Cos’è la fluorescenza?

La fluorescenza è la proprietà di alcuni atomi e molecole di assorbire la luce a una determinata lunghezza d’onda (eccitazione, Ex) con successiva emissione (Em) di breve durata di luce a una lunghezza d’onda maggiore (Figura 2). La distanza tra i picchi di eccitazione e di emissione è nota come spostamento di Stokes e dipende dal fluoroforo (Figura 1).

La fluorescenza richiede una fonte luminosa esterna per eccitare il campione a una determinata lunghezza d’onda. Quando eccitata alla lunghezza d’onda appropriata, la molecola passa da uno stato fondamentale a uno stato eccitato. Quando la molecola ritorna allo stato fondamentale, l’energia viene rilasciata sotto forma di calore (perdita di energia) e luce a una diversa lunghezza d’onda più lunga di energia inferiore (Figura 3).

 

Spostamento di Stokes e dipendenza dal fluoroforo

 

Figura 1

Eccitazione ed emissione di breve durata

 

Figura 2

Lunghezza d’onda di energia inferiore

 

Figura 3

Come funziona la rilevazione della fluorescenza?

Un lettore per micropiastre con rilevazione dell’intensità di fluorescenza (IF) utilizza una sorgente luminosa, solitamente una lampada flash allo xeno o LED, per eccitare un fluoroforo (molecola fluorescente) a una determinata lunghezza d’onda. La lunghezza d’onda necessaria per l’eccitazione del campione può essere selezionata utilizzando un filtro per una lunghezza d’onda specifica o un monocromatore regolato sulla lunghezza d’onda richiesta.

Il fluoroforo emette quindi luce a una lunghezza d’onda diversa, selezionata da un secondo filtro o monocromatore. Questa fluorescenza emessa viene rilevata da un tubo fotomoltiplicatore (Photomultiplier Tube, PMT) e l’intensità della fluorescenza del campione viene espressa in unità di fluorescenza relativa.

 

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