Cos’è la luminescenza?
La luminescenza è l’emissione di luce da parte di una sostanza come risultato di una reazione chimica (chemiluminescenza) o di una reazione enzimatica (bioluminescenza).
La rilevazione della luminescenza è otticamente più semplice della rilevazione della fluorescenza in quanto non richiede una sorgente luminosa o un’ottica specifica per l’eccitazione.
Figura 1 - Reazione di tipo “flash” o “glow”
La luminescenza può essere determinata da una reazione di tipo “flash” o “glow”, a seconda dei profili cinetici. La luminescenza in modalità “flash” fornisce un segnale molto luminoso per un breve lasso di tempo, di solito secondi. La luminescenza in modalità “glow” emette un segnale più stabile, ma solitamente meno intenso, che può durare diversi minuti o ore. La luminescenza in modalità “flash” richiede generalmente un sistema di rilevazione con iniettori in grado di fornire il substrato alla reazione poco prima dell’esecuzione di una misurazione in modo che il segnale non venga perso. Generalmente per la luminescenza sono consigliate micropiastre bianche, perché riflettono la luce e massimizzano il segnale (si veda la Figura 1).
Vantaggi della luminescenza
La luminescenza è una piattaforma di rilevazione estremamente diffusa, utilizzata in un maggior numero di applicazioni rispetto all’assorbanza e alla fluorescenza. Generalmente offre un intervallo dinamico più ampio e una maggiore sensibilità poiché l’interferenza di fondo (autofluorescenza di composti, terreni di coltura e cellule) è bassa. Inoltre, i saggi in luminescenza spesso utilizzano un protocollo omogeneo (senza lavaggio), che li rende più semplici da automatizzare per applicazioni ad alto rendimento.
Panoramica della luminescenza
Definizioni della luminescenza
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Come funziona la rilevazione della luminescenza?
A differenza della fluorescenza, in cui una molecola emette luce in seguito all’eccitazione da parte di una sorgente luminosa esterna, la luminescenza è generata da una reazione chimica o biologica, ad esempio un enzima e il suo substrato. La luce risultante può essere rilevata mediante un tubo fotomoltiplicatore (Photomultiplier Tube, PMT), in cui i fotoni vengono convertiti in elettroni con produzione di una quantità di corrente proporzionale alla quantità di luce. La misurazione del segnale è espressa in unità di luce relativa (Relative Light Units, RLU).
Come funziona un luminometro?
Quando viene allestita una reazione di luminescenza in una micropiastra, si usa un luminometro (o lettore di luminescenza per micropiastre) per misurare la quantità di luce prodotta. La micropiastra viene collocata in una camera di lettura a tenuta di luce e la luce proveniente da ciascun pozzetto viene rilevata in successione mediante un PMT. Le letture di luminescenza sono espresse in RLU.
Nella maggior parte delle applicazioni di luminescenza viene misurata la luce totale prodotta dal campione, senza selezionare lunghezze d’onda specifiche. Tuttavia, per altre applicazioni come il BRET, un lettore di luminescenza per piastre può essere dotato di filtri o monocromatori che consentono la selezione di specifiche lunghezze d’onda per la misurazione di eventi di legame o di altri eventi biomolecolari.
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NanoBRET/BRET
Il trasferimento di energia per risonanza della bioluminescenza (Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET) è una tecnica per la misurazione delle interazioni proteina-proteina o proteina-ligando che prevede l’interazione di un donatore bioluminescente e un accettore fluorescente.
La rilevazione dei segnali NanoBRET e l’analisi dei dati ottenuti richiedono strumentazione sensibile e software avanzato. Registratevi per scoprire di più:
Saggi con geni reporter a singola/doppia luciferasi
I saggi con geni reporter rappresentano strumenti importanti per lo studio dell’espressione genica associata all’attivazione di vie cellulari. Le cellule vengono trasfettate con un plasmide contenente il gene reporter e una sequenza di interesse, solitamente un promotore o un altro elemento di controllo trascrizionale. Quando il promotore è attivato, il gene reporter viene espresso ed è possibile misurarne i livelli.
Scoprite di più sul saggio con geni reporter a doppia luciferasi:
- Monitoraggio dell’attivazione di NF-kB con un sensibile saggio con doppio sistema reporter sul lettore per micropiastre SpectraMax iD5*
- Rilevazione dell’espressione della doppia luciferasi sul lettore per micropiastre FlexStation 3
- Saggi a doppia luciferasi in formati a 96 e 384 pozzetti sul sistema SpectraMax L
- Misurazione dell’espressione della luciferasi utilizzando il kit del saggio reporter SpectraMax Glo Steady-Luc
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Progressi del cliente
L’Università di Ginevra utilizza il lettore per micropiastre SpectraMax® L per i saggi basati sulla luciferasi
Per supportare il suo importante lavoro presso l’Università di Ginevra, il gruppo del dott. Yves Cambet utilizza una varietà di lettori per micropiastre all’avanguardia, tra cui il sistema SpectraMax L per i saggi basati sulla luciferasi.
Specie reattive dell’ossigeno (ROS)
Le specie reattive dell’ossigeno (Reactive Oxygen Species, ROS) sono molecole chimicamente reattive che contengono ossigeno. Negli eucarioti, queste molecole vengono generate principalmente durante la respirazione aerobica e possono causare problemi, come danni al DNA e perossidazione dei lipidi, con conseguenti danni cellulari.
Viene illustrato come possono essere utilizzati i lettori per micropiastre SpectraMax per quantificare in maniera accurata i livelli di ROS utilizzando un saggio basato sulla luminescenza:
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Saggi di citotossicità
La citotossicità viene spesso misurata in risposta a un trattamento sperimentale o a un potenziale farmaco. La disponibilità di un metodo per valutare facilmente la citotossicità in cellule trattate è essenziale per identificare nuovi trattamenti terapeutici o comprendere le vie di segnalazione cellulare che influiscono sulla salute delle cellule. Tra gli indicatori comuni della citotossicità si annoverano il livello di ATP in una popolazione cellulare e l’integrità delle membrane cellulari, caratteristiche che possono essere entrambe misurate con una varietà di saggi basati su micropiastre.
Scoprite di più sulla citotossicità nelle cellule:
Saggi di vitalità cellulare basati sull’ATP
I saggi in luminescenza basati sull’ATP per la vitalità cellulare e la citotossicità offrono un metodo rapido e sensibile per misurare il numero di cellule vitali in coltura e quantificare gli effetti citotossici dei trattamenti sperimentali. Con il lettore per micropiastre SpectraMax®, questi saggi possono essere eseguiti in un formato ad alto rendimento.
Scoprite il saggio di vitalità cellulare in luminescenza CellTiter-Glo e altro:
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ELISA in chemiluminescenza
I fattori di crescita vascolari endoteliali (Vascular Endothelial Growth Factors, VEGF) sono una famiglia di polipeptidi secreti che sono stati implicati nello sviluppo vascolare dei mammiferi e in processi patologici associati a una crescita anormale dei vasi sanguigni.
Scoprite di più sul metodo ELISA in chemiluminescenza utilizzando il nostro luminometro e il nostro software di acquisizione e analisi dei dati:
Monitoraggio dei micoplasmi
I micoplasmi, i procarioti più piccoli e più semplici, sono contaminanti comuni delle colture cellulari. I sintomi della contaminazione da micoplasmi includono una riduzione del tasso di proliferazione e alterazioni delle risposte cellulari, compresa l’espressione genica
Scoprite in che modo i saggi MycoAlert e MycoAlert PLUS di Lonza permettono di rilevare in maniera rapida e conveniente la presenza di micoplasmi vitali nelle colture cellulari utilizzando un lettore di luminescenza per micropiastre
Ultime risorse
Risorse per la luminescenza
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The Ultimate Guide to Microplate Reader Solutions
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La valutazione dei lettori per micropiastre non vi deve travolgere. Per prima cosa considerate le vostre esigenze applicative. Nel caso in cui il budget di cui disponete non sia elevato, un lettore in modalità singola dedicato alla vostra applicazione principale…
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Stazioni di lavoro con lettore per micropiastre per la gestione di molteplici passaggi
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Gli scienziati percorrono varie strade per superare gli ostacoli che incontrano nei flussi di lavoro. Ad esempio, una stazione di lavoro provvista di un lettore per micropiastre può gestire molteplici passaggi, permettendo di migliorare l’efficienza e di aumentare…
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Misurazione dell’interazione tra le proteine p53 e MDM2 con la tecnologia NanoBRET
Measure p53-MDM2 protein interaction with NanoBRET technology
Viene descritta la validazione del lettore SpectraMax® iD5 con la coppia di controllo delle PPI NanoBRET™, costituita dai partner proteici p53 e MDM2 che interagiscono tra loro.
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Molecular Devices presenta il software SoftMax Pro 7,1 GxP di livello aziendale
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Basato sul suo software attuale di acquisizione e analisi dei dati leader del settore, il software SoftMax Pro 7,1 GxP amplia le funzioni di audit trail del sistema includendo indicatori di data e ora;…
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Monitoraggio dell’attivazione di NF-κB con un sensibile saggio con doppio sistema reporter sul lettore per micropiastre SpectraMax iD5
Monitor NF-κB activation with a sensitive dual reporter assay on the SpectraMax iD5 microplate reader
I geni reporter sono strumenti preziosi per lo studio dell’espressione genica, poiché possono essere utilizzati come sostituti di geni coinvolti in varie vie di segnalazione e condizioni patologiche. Le luciferasi sono i geni…
Nota applicativa
Rilevazione dell’espressione della doppia luciferasi sul lettore per micropiastre FlexStation 3
Detect dual luciferase expression on the FlexStation 3 microplate reader
I saggi con geni reporter rappresentano strumenti importanti per lo studio dell’espressione genica associata all’attivazione di vie cellulari. Le cellule vengono trasfettate con un plasmide contenente il gene reporter…
Nota applicativa
Misurazione delle specie reattive dell’ossigeno con i lettori per micropiastre SpectraMax
Measuring reactive oxygen species with SpectraMax microplate readers
Le specie reattive dell’ossigeno (Reactive Oxygen Species, ROS) sono molecole chimicamente reattive che contengono ossigeno. Negli eucarioti, queste molecole vengono generate principalmente durante la respirazione aerobica e possono causare problemi,…
Nota applicativa
Saggi di rilevazione di micoplasmi MycoAlert sui lettori per micropiastre di Molecular Devices
MycoAlert Mycoplasma Detection Assays on Molecular Devices Microplate Readers
I micoplasmi, i procarioti più piccoli e più semplici, sono contaminanti comuni delle colture cellulari. I sintomi della contaminazione da micoplasmi includono una riduzione del tasso di…
Nota applicativa
Citotossicità nelle cellule: facile determinazione utilizzando i saggi biologici ViaLight Plus e ToxiLight di Lonza sul luminometro per micropiastre SpectraMax L
Cytotoxicity in Cells: Easy Determination Using Lonza ViaLight Plus and ToxiLight BioAssays on the SpectraMax L Microplate Luminometer
I saggi di citotossicità in bioluminescenza offrono all’utente limiti di rilevazione più alti, maggiore velocità e migliore accuratezza e sono stati ben documentati. Le cellule sane mantengono un’elevata concentrazione costante di ATP…
Nota applicativa
Saggi a doppia luciferasi in formati a 96 e 384 pozzetti sul nuovo sistema SpectraMax L
Dual-Luciferase assays in 96- and 384-well formats on the new SpectraMax L
I saggi con geni reporter vengono utilizzati per studiare l’espressione dei geni eucariotici. Nei saggi con doppio gene reporter, le cellule vengono trasfettate con due vettori, il primo contenente un…
Nota applicativa
ELISA in chemiluminescenza per il VEGF con il luminometro per micropiastre SpectraMax L
Chemiluminescent VEGF ELISA Using the SpectraMax L Microplate Luminometer
I fattori di crescita vascolari endoteliali (Vascular Endothelial Growth Factors, VEGF) sono una famiglia di polipeptidi secreti che sono stati implicati nello sviluppo vascolare dei mammiferi e in processi patologici…
Nota applicativa
Saggi di vitalità cellulare e citotossicità in luminescenza sul lettore per micropiastre multimodale SpectraMax i3x
Luminescent cell viability and cytotoxicity assays on the SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader
Il saggio CellTiter-Glo di Promega utilizza l’enzima luciferasi, che richiede ATP per generare luce. Il segnale luminescente prodotto nel saggio dipende dalla quantità di ATP presente…
Nota applicativa
La tecnologia NanoBRET sul lettore per micropiastre multimodale SpectraMax i3x
NanoBRET Technology on the SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader
Le interazioni proteina-proteina (Protein-Protein Interactions, PPI) sono essenziali per la segnalazione e le funzioni cellulari. Sono stati utilizzati numerosi metodi per studiare le PPI, tra cui la co-immunoprecipitazione e i saggi di pull-down,…