Contatore di cellule
Al contatore di cellule: Cellule CHO
Le cellule di ovaio di criceto cinese (Chinese Hamster Ovary, CHO) sono una linea cellulare di tipo epiteliale comunemente usata nella ricerca medica e biologica. Sviluppate oltre 50 anni fa, sono state utilizzate in innumerevoli studi che vanno dalla genetica alla citotossicità. Sono altamente suscettibili alla trasfezione e sono diventate la linea cellulare più diffusa per la produzione di proteine ricombinanti, compresi i composti terapeutici.
Visualizza il webinar sulla rilevazione di cellule con la tecnologia StainFree
Scarica la nota applicativa sulla rilevazione di cellule con la tecnologia StainFree
Scarica l’eBook: Count Cells Like a Pro
Figura 1. Analisi StainFree delle cellule CHO mediante l’uso del software SoftMax Pro
Le cellule CHO visualizzate in queste immagini sono state seminate a una densità di 4000 cellule per pozzetto in una micropiastra a 384 pozzetti. Sinistra: Per creare una nuova impostazione per l’analisi StainFree, è stato utilizzato il mouse per “disegnare” sull’immagine, indicando le singole cellule (giallo) o le aree non occupate da cellule (blu). Destra: Le maschere viola mostrano gli oggetti identificati dal software nell’immagine. In alternativa, è possibile utilizzare un’impostazione predefinita di analisi dell’immagine per analizzare le conte delle cellule CHO con un solo clic.
Figura 2. Confronto tra conta cellulare con la tecnologia StainFree e conta cellulare in fluorescenza
Cellule contate utilizzando la tecnologia di rilevazione cellulare StainFree™ (blu), un colorante nucleare rosso (rosso) e un colorante verde per l’intera cellula (verde). Le conte ottenute con tutti e tre i metodi sono altamente concordi, a dimostrazione che la tecnologia StainFree permette di ottenere conte cellulari accurate, eliminando la necessità di coloranti fluorescenti (r > 0,99 per ciascun tracciato).
Figura 3. Confluenza cellulare
La percentuale di confluenza delle cellule subito prima della trasfezione è stata determinata mediante la tecnologia StainFree. Per le densità di semina iniziali di 15000, 10000 e 5000 cellule per pozzetto, la percentuale di confluenza misurata dopo la crescita per tutta la notte è stata pari, rispettivamente, a 44, 30 e 15.
Figura 4. Imaging di cellule trasfettate con GFP
Le cellule trasfettate sono state sottoposte a imaging utilizzando il canale in luce trasmessa (A, C) e quello per la fluorescenza verde (B, D) del citometro per imaging SpectraMax MiniMax 300. Le cellule mostrate sono state seminate a una densità di 15000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Sono mostrate due condizioni di trasfezione, che rappresentano un’efficienza di trasfezione bassa (B) e alta (D). È stata utilizzata la tecnologia StainFree per identificare le singole cellule, che potevano essere classificate come positive o negative per l’espressione di GFP.
Suggerimento 1:
Per contare le cellule CHO senza colorazione, utilizzo l’impostazione predefinita “Cells A” del software SoftMax Pro. Questa impostazione funziona molto bene sulle cellule CHO che presentano una confluenza compresa tra il 5% e il 95%. Siamo riusciti a ottenere un’eccellente correlazione tra le conte eseguite con la tecnologia StainFree e quelle realizzate con la colorazione fluorescente dei nuclei sugli stessi identici campioni (vedere le Fig. 2 e 3).
Suggerimento 2:
Come ottenere conte più accurate con la tecnologia StainFree. Durante l’imaging nel canale in luce trasmessa, invece di utilizzare un’altezza di regolazione del fuoco che fornisce l’immagine più nitida possibile, provate ad abbassare la regolazione del fuoco in una posizione leggermente più negativa, ad es. da 0 a -20. L’obiettivo è fare in modo che le cellule nell’immagine presentino centri brillanti e bordi scuri. Ciò vi permetterà di risparmiare molto tempo e di ottenere risultati migliori con le impostazioni di analisi predefinite.
Kit di strumenti per l’analisi delle cellule CHO
- Piattaforma di rilevazione per micropiastre multimodale SpectraMax® i3
- Citometro per imaging SpectraMax® MiniMax™ 300
- Software SoftMax® Pro
Impostazione dello strumento
Informazione sulla tecnologia di rilevazione cellulare StainFree
Solitamente, i saggi di imaging basati su cellule richiedono l’uso di sonde fluorescenti che possono essere tossiche per le cellule vive o funzionare soltanto in cellule fissate. Un metodo senza marcatura per l’analisi delle conte cellulari e della confluenza cellulare permette ai ricercatori di monitorare in maniera quantitativa la proliferazione e la salute delle cellule senza dover ricorrere a flussi di lavoro laboriosi che potrebbero compromettere la vitalità cellulare.
La piattaforma per micropiastre multimodale SpectraMax i3 con citometro per imaging MiniMax 300 utilizza l’esclusiva tecnologia di rilevazione cellulare StainFree con brevetto depositato per permettervi di eseguire saggi di proliferazione cellulare, di citotossicità e di altro tipo senza coloranti nucleari come il DAPI, che si intercala nel DNA, o coloranti per cellule vive, che a lungo termine sono in realtà tossici per le cellule.