Contatore di cellule
Al contatore di cellule: Cellule HUVEC
Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) sono cellule primarie isolate dalla vena del cordone ombelicale. Rappresentano un sistema modello per lo studio della funzione delle cellule endoteliali, con applicazioni che includono ipossia, infiammazione, stress ossidativo, risposta alle infezioni e angiogenesi fisiologica o associata ai tumori. L’attivazione delle cellule endoteliali, che costituisce una risposta infiammatoria, può essere indotta da citochine come TNF-α e IFN-γ e determina la sovraregolazione di molecole di adesione cellulare come VCAM-1/CD106, che può essere quantificata utilizzando anticorpi marcati in fluorescenza e imaging cellulare.
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Figura 1: Conte cellulari con la tecnologia StainFree
Immagini di cellule HUVEC acquisite con il citometro per imaging SpectraMax i3 MiniMax 300. Le cellule sono state identificate a partire dalle immagini in luce trasmessa utilizzando l’impostazione di analisi predefinita “CellsB”. A sinistra sono mostrate le immagini originali in luce trasmessa e a destra sono visibili le stesse immagini con maschere viola che indicano le cellule identificate dal software. Sono mostrate cellule seminate ad alta (fila superiore) e a bassa (fila inferiore) densità.
Figura 2: Conte cellulari con la tecnologia StainFree e con colorante nucleare fluorescente
Cellule HUVEC seminate a densità comprese tra 156 e 20.000 cellule per pozzetto sono state contate utilizzando la tecnologia StainFree (cerchietti blu) oppure sono state colorate con il colorante EarlyTox™ Live Red Dye, dopodiché sono stati contati i nuclei fluorescenti rossi (cerchietti rossi). Le conte cellulari ottenute con i due metodi hanno presentato un elevato tasso di concordanza lungo l’intero intervallo di densità delle cellule.
Figura 3: Espressione di VCAM-1/CD106 indotta da citochine nelle cellule HUVEC
Cellule HUVEC trattate con le citochine TNF-α e IFN-γ (sinistra) o non trattate (destra) sono state colorate con un anticorpo anti-VCAM-1/CD106 marcato con FITC e visualizzate con il citometro per imaging SpectraMax MiniMax 300.
Figura 4: Inibizione dell’espressione di VCAM-1/CD106 indotta da citochine nelle cellule HUVEC
Le cellule HUVEC sono state seminate a una densità di 10.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti e lasciate attaccare e crescere per tutta la notte. Sono state trattate con le citochine TNF-α e IFN-γ, nonché con diverse concentrazioni di SB202190, un inibitore della chinasi p38 MAP, per 24 ore e poi colorate con un anticorpo anti-VCAM-1/CD106 marcato con FITC. Sono stati inclusi controlli non trattati con l’inibitore o le citochine.
Suggerimento:
Le cellule HUVEC presentano un tipico aspetto a forma di ciottolo. Per la conta con la tecnologia StainFree, l’impostazione per l’analisi delle immagini preconfigurata “CellsB” del software SoftMax Pro funziona molto bene. In alternativa, quando si contano cellule che hanno subito alterazioni della morfologia a causa del trattamento con citochine, etc., può essere utile creare una nuova impostazione di analisi disegnando sulle immagini delle cellule.
Kit di strumenti per l’analisi delle cellule HUVEC
- Piattaforma di rilevazione per micropiastre multimodale SpectraMax ® i3
- Citometro per imaging SpectraMax ® MiniMax™ 300
- Software SoftMax ® Pro
Tipo di analisi: Analisi di oggetti distinti
Lunghezza d’onda per l’identificazione di oggetti: TL
Informazione sulla tecnologia di rilevazione cellulare StainFree
Solitamente, i saggi di imaging basati su cellule richiedono l’uso di sonde fluorescenti che possono essere tossiche per le cellule vive o funzionare soltanto in cellule fissate. Un metodo senza marcatura per l’analisi delle conte cellulari e della confluenza cellulare permette ai ricercatori di monitorare in maniera quantitativa la proliferazione e la salute delle cellule senza dover ricorrere a flussi di lavoro laboriosi che potrebbero compromettere la vitalità cellulare.
La piattaforma per micropiastre multimodale SpectraMax i3 con citometro per imaging MiniMax 300 utilizza l’esclusiva tecnologia di rilevazione cellulare StainFree con brevetto depositato per permettervi di eseguire saggi di proliferazione cellulare, di citotossicità e di altro tipo senza coloranti nucleari come il DAPI, che si intercala nel DNA, o coloranti per cellule vive, che a lungo termine sono in realtà tossici per le cellule.