GPCR (recettori accoppiati a proteina G)
I GPCR, o recettori accoppiati a proteina G, sono proteine localizzate sulla superficie cellulare che riconoscono le sostanze extracellulari e trasmettono segnali attraverso la membrana cellulare. Per compiere questa funzione, i GPCR attivano proteine leganti il nucleotide guanina (proteine G) che sono responsabili per la trasduzione del segnale all’interno della cellula. La trasmissione del segnale è molto importante in varie risposte cellulari, tra cui la crescita cellulare, la trascrizione genica, le modifiche post-traduzionali e la comunicazione con le altre cellule. Questo processo determina regolazioni che permettono all’organismo di adattarsi alle variazioni ambientali, come un aumento della frequenza cardiaca quando ci sentiamo minacciati o alterazioni della vista in risposta a condizioni di scarsa illuminazione.
Il solo genoma umano contiene almeno 1.000 GPCR diversi in grado di rilevare, tra le altre cose, ormoni, lipidi, ammine, neurotrasmettitori e luce.
Un GPCR è costituito da tre regioni. La parte extracellulare rileva e si lega al ligando. Quindi, la regione con sette domini transmembrana subisce una modifica conformazionale. Infine, questa modifica attiva la parte C-terminale che aziona la proteina G corrispondente.
I cardiomiociti derivati da cellule iPS sono modelli cellulari particolarmente interessanti perché presentano profili di espressione genica e caratteristiche fenotipiche simili a quelli delle cellule cardiache native.
Recettori accoppiati a proteina G e canali ionici
I GPCR sono la famiglia proteica più grande, composta da 600 a 1000 membri, e sono stati associati a numerose condizioni biologiche normali e patologiche. Sono conosciuti anche come recettori a sette domini transmembrana (7-TM) e circa il 45% dei farmaci moderni agisce su questa classe di target. I GPCR svolgono funzioni molto diverse, riconoscendo un’ampia varietà di ligandi, tra cui fotoni, piccole molecole e proteine.
I canali ionici sono pori nella membrana cellulare che permettono l’ingresso e l’uscita di ioni dalle cellule. Esistono oltre 400 geni che codificano per canali ionici nel genoma umano. Molti di essi sono bersagli di farmaci che hanno oggi grande successo. La misurazione diretta dell’attività dei canali ionici viene eseguita mediante apparecchiature di elettrofisiologia tradizionali per patch-clamp. Tuttavia, il rendimento di questo approccio è molto basso. L’attività dei canali ionici può anche essere misurata in maniera indiretta con un rendimento molto più elevato mediante l’uso di fluorofori sensibili alle variazioni del potenziale di membrana, del flusso di calcio e del flusso di potassio.
Monitoraggio dell’attività dei GPCR per la scoperta farmacologica
Le alterazioni nell’attività dei GPCR determinano anomalie nelle vie di segnalazione cellulare, che provocano infiammazione, malattie cardiovascolari, disturbi mentali, squilibri ormonali e tumori. Per tale motivo, i GPCR sono al centro della scoperta farmacologica e circa il 34% di tutti i farmaci approvati dalla FDA è diretto contro 108 GPCR ben definiti.
Nella scoperta farmacologica possono essere utilizzati vari saggi per monitorare l’attività dei GPCR e le corrispondenti alterazioni intracellulari.
Il calcio è un importante messaggero innescato dall’attività dei GPCR. Pertanto, le variazioni nella segnalazione associata al calcio intracellulare sono forti indicatori dello stato di attivazione dei GPCR. I saggi per il flusso del calcio possono essere utilizzati per monitorare i livelli di calcio intracellulare nello screening farmacologico.
Il monitoraggio delle oscillazioni del calcio è fondamentale anche per prevedere in vitro la tossicità dei farmaci candidati.
L’adenosina monofosfato ciclico (cyclic Adenosine Monophosphate, cAMP) è un altro messaggero importante coinvolto nelle vie di trasduzione del segnale. L’esistenza di variazioni nei livelli intracellulari di cAMP indica l’accoppiamento specifico di GPCR-proteine G. I saggi per il cAMP forniscono valide informazioni sui sottotipi di GPCR.
È anche possibile monitorare l’attività dei GPCR mediante saggi Transfluor, che sono incentrati principalmente sulla desensibilizzazione dei GPCR dopo il legame del ligando. Questi saggi possono essere implementati nelle attività di screening farmacologico per monitorare l’attivazione/disattivazione dei GPCR e i movimenti attraverso la membrana cellulare.
Soluzioni per l’identificazione precoce di composti guida diretti contro i GPCR
Offriamo una varietà di soluzioni che includono saggi e strumenti per sostenere gli studi sulla funzione dei GPCR e dei canali ionici, tra cui kit di saggi, sistemi di imaging e screening cellulare e lettori per micropiastre.
Qui ci concentriamo su applicazioni che utilizzano il sistema di screening cellulare ad alto rendimento FLIPR, il modulo software Screenworks Peak Pro 2 e vari kit di saggi FLIPR per fornire una soluzione per lo screening cinetico ad alto rendimento per gli studi di tossicologia e l’identificazione di composti guida.