RISPOSTA ALLA COVID-19. Nel corso di questa pandemia siamo impegnati a sostenere la nostra comunità scientifica. Scopri di più

GPCR (recettori accoppiati a proteina G)

GPCR (recettori accoppiati a proteina G)

I GPCR, o recettori accoppiati a proteina G, sono proteine localizzate sulla superficie cellulare che riconoscono le sostanze extracellulari e trasmettono segnali attraverso la membrana cellulare. Per compiere questa funzione, i GPCR attivano proteine leganti il nucleotide guanina (proteine G) che sono responsabili per la trasduzione del segnale all’interno della cellula. La trasmissione del segnale è molto importante in varie risposte cellulari, tra cui la crescita cellulare, la trascrizione genica, le modifiche post-traduzionali e la comunicazione con le altre cellule. Questo processo determina regolazioni che permettono all’organismo di adattarsi alle variazioni ambientali, come un aumento della frequenza cardiaca quando ci sentiamo minacciati o alterazioni della vista in risposta a condizioni di scarsa illuminazione.

Il solo genoma umano contiene almeno 1.000 GPCR diversi in grado di rilevare, tra le altre cose, ormoni, lipidi, ammine, neurotrasmettitori e luce.

Un GPCR è costituito da tre regioni. La parte extracellulare rileva e si lega al ligando. Quindi, la regione con sette domini transmembrana subisce una modifica conformazionale. Infine, questa modifica attiva la parte C-terminale che aziona la proteina G corrispondente.


screening dei cardiomiociti

I cardiomiociti derivati da cellule iPS sono modelli cellulari particolarmente interessanti perché presentano profili di espressione genica e caratteristiche fenotipiche simili a quelli delle cellule cardiache native.

Recettori accoppiati a proteina G e canali ionici

 

I GPCR sono la famiglia proteica più grande, composta da 600 a 1000 membri, e sono stati associati a numerose condizioni biologiche normali e patologiche. Sono conosciuti anche come recettori a sette domini transmembrana (7-TM) e circa il 45% dei farmaci moderni agisce su questa classe di target. I GPCR svolgono funzioni molto diverse, riconoscendo un’ampia varietà di ligandi, tra cui fotoni, piccole molecole e proteine.

I canali ionici sono pori nella membrana cellulare che permettono l’ingresso e l’uscita di ioni dalle cellule. Esistono oltre 400 geni che codificano per canali ionici nel genoma umano. Molti di essi sono bersagli di farmaci che hanno oggi grande successo. La misurazione diretta dell’attività dei canali ionici viene eseguita mediante apparecchiature di elettrofisiologia tradizionali per patch-clamp. Tuttavia, il rendimento di questo approccio è molto basso. L’attività dei canali ionici può anche essere misurata in maniera indiretta con un rendimento molto più elevato mediante l’uso di fluorofori sensibili alle variazioni del potenziale di membrana, del flusso di calcio e del flusso di potassio.

 

Monitoraggio dell’attività dei GPCR per la scoperta farmacologica

 

Le alterazioni nell’attività dei GPCR determinano anomalie nelle vie di segnalazione cellulare, che provocano infiammazione, malattie cardiovascolari, disturbi mentali, squilibri ormonali e tumori. Per tale motivo, i GPCR sono al centro della scoperta farmacologica e circa il 34% di tutti i farmaci approvati dalla FDA è diretto contro 108 GPCR ben definiti.

Nella scoperta farmacologica possono essere utilizzati vari saggi per monitorare l’attività dei GPCR e le corrispondenti alterazioni intracellulari.

Il calcio è un importante messaggero innescato dall’attività dei GPCR. Pertanto, le variazioni nella segnalazione associata al calcio intracellulare sono forti indicatori dello stato di attivazione dei GPCR. I saggi per il flusso del calcio possono essere utilizzati per monitorare i livelli di calcio intracellulare nello screening farmacologico.

Il monitoraggio delle oscillazioni del calcio è fondamentale anche per prevedere in vitro la tossicità dei farmaci candidati.

L’adenosina monofosfato ciclico (cyclic Adenosine Monophosphate, cAMP) è un altro messaggero importante coinvolto nelle vie di trasduzione del segnale. L’esistenza di variazioni nei livelli intracellulari di cAMP indica l’accoppiamento specifico di GPCR-proteine G. I saggi per il cAMP forniscono valide informazioni sui sottotipi di GPCR.

È anche possibile monitorare l’attività dei GPCR mediante saggi Transfluor, che sono incentrati principalmente sulla desensibilizzazione dei GPCR dopo il legame del ligando. Questi saggi possono essere implementati nelle attività di screening farmacologico per monitorare l’attivazione/disattivazione dei GPCR e i movimenti attraverso la membrana cellulare.

 

Soluzioni per l’identificazione precoce di composti guida diretti contro i GPCR

 

Offriamo una varietà di soluzioni che includono saggi e strumenti per sostenere gli studi sulla funzione dei GPCR e dei canali ionici, tra cui kit di saggi, sistemi di imaging e screening cellulare e lettori per micropiastre.

Qui ci concentriamo su applicazioni che utilizzano il sistema di screening cellulare ad alto rendimento FLIPR, il modulo software Screenworks Peak Pro 2 e vari kit di saggi FLIPR per fornire una soluzione per lo screening cinetico ad alto rendimento per gli studi di tossicologia e l’identificazione di composti guida.

 

  • Cardiomiocita

    Cardiomiocita

    Una previsione precoce della cardiotossicità funzionale indotta da farmaci esige robusti sistemi in vitro adatti per lo screening ad alto rendimento. È possibile utilizzare cardiomiociti umani derivati da iPSC, che sono facili da ottenere, in combinazione con coloranti sensibili al calcio, monitorando le frequenze e i pattern di battito come variazioni del calcio intracellulare in risposta all’attivazione dei GPCR e dei canali ionici. Questi picchi del calcio possono essere analizzati con il nostro software ScreenWorks PeakPro 2, che fornisce ai ricercatori una serie di potenti strumenti per la quantificazione dell'attività dei cardiomiociti.

    Leggete le note applicative:

    Cardiotossicità: oscillazioni del calcio

    Cardiotossicità: Oscillazioni del calcio

    I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (induced Pluripotent Stem Cells, iPSC) sono un sistema modello in vitro particolarmente interessante in virtù del loro uso per la valutazione degli effetti dei composti sulla sicurezza e sulla funzione del cuore. L’oscillazione dei segnali del calcio riflette le variazioni nella concentrazione del calcio citoplasmatico, rendendo possibile l’uso di un colorante sensibile al calcio come quello incluso nel kit per la cardiotossicità EarlyTox.

    Leggete le note applicative:

  • Valutazione del flusso di calcio

    Flusso del calcio

    La valutazione del flusso del calcio è una misura dell'attività cellulare accettata da lungo tempo, testata e reale. Il flusso del calcio può essere usato come misurazione per tutta una gamma di processi cellulari, inclusi il rilascio di neurotrasmettitori, l'attività dei GPCR, i canali ionici ligando-dipendenti e i profili di battito dei cardiomiociti, tra molti altri. Il sistema FLIPR è lo strumento di scoperta farmacologica ideale per la valutazione del flusso del calcio nei processi di screening a rendimento alto e ultra-alto per via della sua facilità di utilizzo, sensibilità e configurabilità da parte dell'utente.

    Scoprite di più:

    Fura-2 QBT per il calcio

    Fura-2 QBT per il calcio

    Il colorante Fura-2 è stato a lungo considerato uno strumento importante per misurare la mobilizzazione del calcio nell’imaging cellulare, il flusso di calcio intracellulare mediato da GPCR e l’attivazione di canali ionici. Questo colorante raziometrico aiuta a correggere la mancanza di omogeneità dei saggi per quanto riguarda il caricamento del colorante o la semina delle cellule attraverso il calcolo del rapporto tra l’intensità della fluorescenza degli indicatori legati e di quelli liberi. Tuttavia, sono necessarie procedure di lavaggio, che incrementano la variabilità tra i pozzetti e aumentano la durata e la complessità di ciascun saggio.

    Il kit per il calcio Fura-2 QBT™ di Molecular Devices incorpora una comprovata tecnologia basata sul quenching con il Fura-2, un indicatore raziometrico del calcio, per garantire l’omogeneità del saggio in modo da ridurre al minimo la variabilità associata alle cellule, aumentando allo stesso tempo il rendimento mediante l’eliminazione delle procedure di lavaggio cellulare prima della rilevazione.

    Scoprite di più:

  • Soluzione omogenea per i saggi sui GPCR

    Soluzione omogenea per i saggi sui GPCR

    I saggi basati su cellule sono diventati una metodica indispensabile per lo screening e la profilazione dei composti nelle fasi precoci dei processi di scoperta farmacologica. Finora, questi saggi si sono dimostrati tra i metodi più affidabili e riproducibili negli studi di caratterizzazione dei recettori, nelle procedure di screening primario e nei programmi di profilazione dei composti. In particolare per i target dei GPCR accoppiati a proteina Gq, la metodologia di elezione è rappresentata da saggi omogenei in fluorescenza per il flusso del calcio con tecnologia di mascheramento.

    Combinando un nuovo fluoroforo e una tecnologia di mascheramento consolidata, il kit del saggio FLIPR Calcium 5 offre risultati farmacologici affidabili, una finestra di segnale più ampia e migliori prestazioni analitiche. Con il kit del saggio FLIPR Calcium 5 e il sistema FLIPR, è possibile eseguire lo screening uniforme di una varietà di recettori e di target, specialmente quelli con piccole risposte ai segnali del calcio, in un formato omogeneo e facile da usare.

    Leggete la nota applicativa:

    Segnalazione del secondo messaggero dei GPCR accoppiati a Gi e a Gs in cellule vive

    Segnalazione del secondo messaggero dei GPCR

    La rilevazione dell’attività del segnale del secondo messaggero dei GPCR accoppiati a proteine Gi e Gs è stata tradizionalmente eseguita mediante saggi basati sul legame di composti radioattivi o saggi per il cAMP al punto finale che richiedono la lisi cellulare. Tali saggi permettono di misurare l’attività in un singolo punto temporale nel corso della risposta cellulare e non forniscono informazioni di tipo cinetico. Un’altra opzione prevede l’accoppiamento forzato di GPCR accoppiati a proteina Gi e Gs a Gα16, seguito dalla rilevazione della fluorescenza del flusso di calcio dopo l’attivazione del recettore dell’agonista. Anche in questo caso, il saggio è subottimale poiché non si basa sulla segnalazione attraverso la via del cAMP biologicamente rilevante.

    Qui è dimostrata l’attività del recettore endogeno in linee cellulari CHO-K1 e HEK-293 che esprimono stabilmente il plasmide GloSensor utilizzando il sistema FLIPR.

    Leggete la nota applicativa:

  • Saggi cinetici su cellule vive

    Saggi cinetici su cellule vive

    I sistemi di imaging ad alto contenuto ImageXpress Confocal e Micro 4 offrono moduli opzionali di fluidica e controllo ambientale, che permettono il pipettamento monocanale per l’aggiunta di composti e la sostituzione del terreno durante esperimenti di cinetica rapida e in time-lapse prolungati. Il kit del saggio per i GPCR basato su cellule Transfluor è uno strumento utile adoperato durante lo screening ad alto contenuto (High-Content Screening, HCS) per monitorare l’attivazione dei recettori accoppiati a proteina G (G-Protein Coupled Receptor, GPCR) quantificando la desensibilizzazione e il riciclo dei GPCR mediante ß-arrestina marcata con GFP con analisi automatizzata delle immagini.

    Leggete la nota applicativa:

    Misurazione del flusso di calcio intracellulare

    Confronto delle misurazioni del calcio intracellulare

    I recettori accoppiati a proteina G (G-Protein Coupled Receptors, GPCR) svolgono un ruolo importante nella segnalazione cellulare. Quando il recettore viene attivato da un ligando, la sua conformazione cambia, determinando l’attivazione della proteina G all’interno della cellula. Una proteina G attiva ha la potenzialità di indurre varie cascate di messaggeri intracellulari, tra cui il calcio. Il sistema FLIPR permette di eseguire saggi funzionali ad alto rendimento basati su cellule ed è il sistema di elezione nella scoperta farmacologica per la valutazione delle variazioni nei livelli di calcio intracellulare rilevate attraverso l’uso di coloranti reporter fluorescenti sensibili al calcio. Qui è descritto un protocollo di base per l’esecuzione di un saggio per la mobilizzazione del calcio sul sistema FLIPR utilizzando il kit del saggio per il calcio FLIPR®, un saggio in fluorescenza omogeneo, rapido e affidabile.

    Leggete la nota applicativa:

  • Monitoraggio dell’attività dei recettori accoppiati a proteina Gq

    Monitoraggio dell’attività dei recettori accoppiati a proteina Gq

    L’attivazione dei recettori accoppiati a proteina Gq viene comunemente monitorata in tempo reale nelle cellule vive utilizzando coloranti sensibili al calcio su un lettore di fluorescenza per piastre. Generalmente è necessaria la gestione automatizzata dei liquidi nel lettore per piastre per somministrare composti agonisti alle cellule nella micropiastra, mentre il sistema di rilevazione esegue letture in tempo reale delle variazioni indotte dai composti, espresse in valori di intensità di fluorescenza. L’analisi delle letture cinetiche ottenute fornisce informazioni sui profili di risposta dei composti, compresi i valori EC50 e IC50 per gli agonisti e gli antagonisti.

    Leggete la nota applicativa:

    Saggi neuronali

    Saggi neuronali

    Il sistema FLIPR è uno strumento eccellente per il monitoraggio del flusso del calcio correlato all'attività neuronale. I neuroni iPSC di recente sviluppo, disponibili in commercio, hanno reso possibile lo screening neuronale ad alto rendimento. Queste cellule e saggi sono essenziali per monitorare tutta una serie di fattori, tra cui le condizioni di coltura cellulare neuronale, gli effetti dei composti farmacologici e l'effetto delle neorotossine ambientali. L'attività neuronale e il rilascio di neurotrasmettitori possono essere valutati con coloranti indicatori del calcio basati sulla fluorescenza che combinano saggi rapidi, semplici e potenti con un rendimento scalabile.

    Scoprite di più:

Ultime risorse

Risorse per i GPCR (recettori accoppiati a proteina G)

Prodotti e servizi correlati dei GPCR (recettori accoppiati a proteina G)