GPCR (recettori accoppiati a proteina G)
I GPCR, o recettori accoppiati a proteina G, sono proteine localizzate sulla superficie cellulare che riconoscono le sostanze extracellulari e trasmettono segnali attraverso la membrana cellulare. Per compiere questa funzione, i GPCR attivano proteine leganti il nucleotide guanina (proteine G) che sono responsabili per la trasduzione del segnale all’interno della cellula. La trasmissione del segnale è molto importante in varie risposte cellulari, tra cui la crescita cellulare, la trascrizione genica, le modifiche post-traduzionali e la comunicazione con le altre cellule. Questo processo determina regolazioni che permettono all’organismo di adattarsi alle variazioni ambientali, come un aumento della frequenza cardiaca quando ci sentiamo minacciati o alterazioni della vista in risposta a condizioni di scarsa illuminazione.
Il solo genoma umano contiene almeno 1.000 GPCR diversi in grado di rilevare, tra le altre cose, ormoni, lipidi, ammine, neurotrasmettitori e luce.
Un GPCR è costituito da tre regioni. La parte extracellulare rileva e si lega al ligando. Quindi, la regione con sette domini transmembrana subisce una modifica conformazionale. Infine, questa modifica attiva la parte C-terminale che aziona la proteina G corrispondente.

I cardiomiociti derivati da cellule iPS sono modelli cellulari particolarmente interessanti perché presentano profili di espressione genica e caratteristiche fenotipiche simili a quelli delle cellule cardiache native.
Recettori accoppiati a proteina G e canali ionici
I GPCR sono la famiglia proteica più grande, composta da 600 a 1000 membri, e sono stati associati a numerose condizioni biologiche normali e patologiche. Sono conosciuti anche come recettori a sette domini transmembrana (7-TM) e circa il 45% dei farmaci moderni agisce su questa classe di target. I GPCR svolgono funzioni molto diverse, riconoscendo un’ampia varietà di ligandi, tra cui fotoni, piccole molecole e proteine.
I canali ionici sono pori nella membrana cellulare che permettono l’ingresso e l’uscita di ioni dalle cellule. Esistono oltre 400 geni che codificano per canali ionici nel genoma umano. Molti di essi sono bersagli di farmaci che hanno oggi grande successo. La misurazione diretta dell’attività dei canali ionici viene eseguita mediante apparecchiature di elettrofisiologia tradizionali per patch-clamp. Tuttavia, il rendimento di questo approccio è molto basso. L’attività dei canali ionici può anche essere misurata in maniera indiretta con un rendimento molto più elevato mediante l’uso di fluorofori sensibili alle variazioni del potenziale di membrana, del flusso di calcio e del flusso di potassio.
Monitoraggio dell’attività dei GPCR per la scoperta farmacologica
Le alterazioni nell’attività dei GPCR determinano anomalie nelle vie di segnalazione cellulare, che provocano infiammazione, malattie cardiovascolari, disturbi mentali, squilibri ormonali e tumori. Per tale motivo, i GPCR sono al centro della scoperta farmacologica e circa il 34% di tutti i farmaci approvati dalla FDA è diretto contro 108 GPCR ben definiti.
Nella scoperta farmacologica possono essere utilizzati vari saggi per monitorare l’attività dei GPCR e le corrispondenti alterazioni intracellulari.
Il calcio è un importante messaggero innescato dall’attività dei GPCR. Pertanto, le variazioni nella segnalazione associata al calcio intracellulare sono forti indicatori dello stato di attivazione dei GPCR. I saggi per il flusso del calcio possono essere utilizzati per monitorare i livelli di calcio intracellulare nello screening farmacologico.
Il monitoraggio delle oscillazioni del calcio è fondamentale anche per prevedere in vitro la tossicità dei farmaci candidati.
L’adenosina monofosfato ciclico (cyclic Adenosine Monophosphate, cAMP) è un altro messaggero importante coinvolto nelle vie di trasduzione del segnale. L’esistenza di variazioni nei livelli intracellulari di cAMP indica l’accoppiamento specifico di GPCR-proteine G. I saggi per il cAMP forniscono valide informazioni sui sottotipi di GPCR.
È anche possibile monitorare l’attività dei GPCR mediante saggi Transfluor, che sono incentrati principalmente sulla desensibilizzazione dei GPCR dopo il legame del ligando. Questi saggi possono essere implementati nelle attività di screening farmacologico per monitorare l’attivazione/disattivazione dei GPCR e i movimenti attraverso la membrana cellulare.
Soluzioni per l’identificazione precoce di composti guida diretti contro i GPCR
Offriamo una varietà di soluzioni che includono saggi e strumenti per sostenere gli studi sulla funzione dei GPCR e dei canali ionici, tra cui kit di saggi, sistemi di imaging e screening cellulare e lettori per micropiastre.
Qui ci concentriamo su applicazioni che utilizzano il sistema di screening cellulare ad alto rendimento FLIPR, il modulo software Screenworks Peak Pro 2 e vari kit di saggi FLIPR per fornire una soluzione per lo screening cinetico ad alto rendimento per gli studi di tossicologia e l’identificazione di composti guida.
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Cardiomiocita
Una previsione precoce della cardiotossicità funzionale indotta da farmaci esige robusti sistemi in vitro adatti per lo screening ad alto rendimento. È possibile utilizzare cardiomiociti umani derivati da iPSC, che sono facili da ottenere, in combinazione con coloranti sensibili al calcio, monitorando le frequenze e i pattern di battito come variazioni del calcio intracellulare in risposta all’attivazione dei GPCR e dei canali ionici. Questi picchi del calcio possono essere analizzati con il nostro software ScreenWorks PeakPro 2, che fornisce ai ricercatori una serie di potenti strumenti per la quantificazione dell'attività dei cardiomiociti.
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Cardiotossicità: oscillazioni del calcio
I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (induced Pluripotent Stem Cells, iPSC) sono un sistema modello in vitro particolarmente interessante in virtù del loro uso per la valutazione degli effetti dei composti sulla sicurezza e sulla funzione del cuore. L’oscillazione dei segnali del calcio riflette le variazioni nella concentrazione del calcio citoplasmatico, rendendo possibile l’uso di un colorante sensibile al calcio come quello incluso nel kit per la cardiotossicità EarlyTox™.
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Valutazione del flusso di calcio
La valutazione del flusso del calcio è una misura dell'attività cellulare accettata da lungo tempo, testata e reale. Il flusso del calcio può essere usato come misurazione per tutta una gamma di processi cellulari, inclusi il rilascio di neurotrasmettitori, l'attività dei GPCR, i canali ionici ligando-dipendenti e i profili di battito dei cardiomiociti, tra molti altri. Il sistema FLIPR è lo strumento di scoperta farmacologica ideale per la valutazione del flusso del calcio nei processi di screening a rendimento alto e ultra-alto per via della sua facilità di utilizzo, sensibilità e configurabilità da parte dell'utente.
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Fura-2 QBT per il calcio
Il colorante Fura-2 è stato a lungo considerato uno strumento importante per misurare la mobilizzazione del calcio nell’imaging cellulare, il flusso di calcio intracellulare mediato da GPCR e l’attivazione di canali ionici. Questo colorante raziometrico aiuta a correggere la mancanza di omogeneità dei saggi per quanto riguarda il caricamento del colorante o la semina delle cellule attraverso il calcolo del rapporto tra l’intensità della fluorescenza degli indicatori legati e di quelli liberi. Tuttavia, sono necessarie procedure di lavaggio, che incrementano la variabilità tra i pozzetti e aumentano la durata e la complessità di ciascun saggio.
Il kit per il calcio Fura-2 QBT™ di Molecular Devices incorpora una comprovata tecnologia basata sul quenching con il Fura-2, un indicatore raziometrico del calcio, per garantire l’omogeneità del saggio in modo da ridurre al minimo la variabilità associata alle cellule, aumentando allo stesso tempo il rendimento mediante l’eliminazione delle procedure di lavaggio cellulare prima della rilevazione.
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Soluzione omogenea per i saggi sui GPCR
I saggi basati su cellule sono diventati una metodica indispensabile per lo screening e la profilazione dei composti nelle fasi precoci dei processi di scoperta farmacologica. Finora, questi saggi si sono dimostrati tra i metodi più affidabili e riproducibili negli studi di caratterizzazione dei recettori, nelle procedure di screening primario e nei programmi di profilazione dei composti. In particolare per i target dei GPCR accoppiati a proteina Gq, la metodologia di elezione è rappresentata da saggi omogenei in fluorescenza per il flusso del calcio con tecnologia di mascheramento.
Combinando un nuovo fluoroforo e una tecnologia di mascheramento consolidata, il kit del saggio FLIPR Calcium 5 offre risultati farmacologici affidabili, una finestra di segnale più ampia e migliori prestazioni analitiche. Con il kit del saggio FLIPR Calcium 5 e il sistema FLIPR, è possibile eseguire lo screening uniforme di una varietà di recettori e di target, specialmente quelli con piccole risposte ai segnali del calcio, in un formato omogeneo e facile da usare.
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Segnalazione del secondo messaggero dei GPCR accoppiati a Gi e a Gs in cellule vive
La rilevazione dell’attività del segnale del secondo messaggero dei GPCR accoppiati a proteine Gi e Gs è stata tradizionalmente eseguita mediante saggi basati sul legame di composti radioattivi o saggi per il cAMP al punto finale che richiedono la lisi cellulare. Tali saggi permettono di misurare l’attività in un singolo punto temporale nel corso della risposta cellulare e non forniscono informazioni di tipo cinetico. Un’altra opzione prevede l’accoppiamento forzato di GPCR accoppiati a proteina Gi e Gs a Gα16, seguito dalla rilevazione della fluorescenza del flusso di calcio dopo l’attivazione del recettore dell’agonista. Anche in questo caso, il saggio è subottimale poiché non si basa sulla segnalazione attraverso la via del cAMP biologicamente rilevante.
Qui è dimostrata l’attività del recettore endogeno in linee cellulari CHO-K1 e HEK-293 che esprimono stabilmente il plasmide GloSensor™ utilizzando il sistema FLIPR.
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Saggi cinetici su cellule vive
I sistemi di imaging ad alto contenuto ImageXpress Confocal e Micro 4 offrono moduli opzionali di fluidica e controllo ambientale, che permettono il pipettamento monocanale per l’aggiunta di composti e la sostituzione del terreno durante esperimenti di cinetica rapida e in time-lapse prolungati. Il kit del saggio per i GPCR basato su cellule Transfluor è uno strumento utile adoperato durante lo screening ad alto contenuto (High-Content Screening, HCS) per monitorare l’attivazione dei recettori accoppiati a proteina G (G-Protein Coupled Receptor, GPCR) quantificando la desensibilizzazione e il riciclo dei GPCR mediante ß-arrestina marcata con GFP con analisi automatizzata delle immagini.
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Misurazione del flusso di calcio intracellulare
I recettori accoppiati a proteina G (G-Protein Coupled Receptors, GPCR) svolgono un ruolo importante nella segnalazione cellulare. Quando il recettore viene attivato da un ligando, la sua conformazione cambia, determinando l’attivazione della proteina G all’interno della cellula. Una proteina G attiva ha la potenzialità di indurre varie cascate di messaggeri intracellulari, tra cui il calcio. Il sistema FLIPR permette di eseguire saggi funzionali ad alto rendimento basati su cellule ed è il sistema di elezione nella scoperta farmacologica per la valutazione delle variazioni nei livelli di calcio intracellulare rilevate attraverso l’uso di coloranti reporter fluorescenti sensibili al calcio. Qui è descritto un protocollo di base per l’esecuzione di un saggio per la mobilizzazione del calcio sul sistema FLIPR utilizzando il kit del saggio per il calcio FLIPR®, un saggio in fluorescenza omogeneo, rapido e affidabile.
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Monitoraggio dell’attività dei recettori accoppiati a proteina Gq
L’attivazione dei recettori accoppiati a proteina Gq viene comunemente monitorata in tempo reale nelle cellule vive utilizzando coloranti sensibili al calcio su un lettore di fluorescenza per piastre. Generalmente è necessaria la gestione automatizzata dei liquidi nel lettore per piastre per somministrare composti agonisti alle cellule nella micropiastra, mentre il sistema di rilevazione esegue letture in tempo reale delle variazioni indotte dai composti, espresse in valori di intensità di fluorescenza. L’analisi delle letture cinetiche ottenute fornisce informazioni sui profili di risposta dei composti, compresi i valori EC50 e IC50 per gli agonisti e gli antagonisti.
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Saggi neuronali
Il sistema FLIPR è uno strumento eccellente per il monitoraggio del flusso del calcio correlato all'attività neuronale. I neuroni iPSC di recente sviluppo, disponibili in commercio, hanno reso possibile lo screening neuronale ad alto rendimento. Queste cellule e saggi sono essenziali per monitorare tutta una serie di fattori, tra cui le condizioni di coltura cellulare neuronale, gli effetti dei composti farmacologici e l'effetto delle neorotossine ambientali. L'attività neuronale e il rilascio di neurotrasmettitori possono essere valutati con coloranti indicatori del calcio basati sulla fluorescenza che combinano saggi rapidi, semplici e potenti con un rendimento scalabile.
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- Profilazione della neurotossicità mediante l’uso di sferoidi neurali 3D derivati da iPSC umane
- Caratterizzazione fenotipica degli effetti di composti neuroattivi
- Saggi multiplex per la valutazione della neurotossicità mediante l’uso di modelli 3D di cellule neurali
- Analisi di eventi complessi per la profilazione neurotossica degli effetti di composti su colture 3D di sferoidi neurali derivati da iPSC umane
Ultime risorse
Risorse per i GPCR (recettori accoppiati a proteina G)
Nota applicativa
Caratterizzazione fenotipica degli effetti di composti neuroattivi
Phenotypic characterization of neuroactive compound effects
Il sistema FLIPR Penta è dotato di una videocamera EMCCD ad alta velocità e del nuovo software ScreenWorks Peak Pro 2. Questo sistema permette la misurazione e l’analisi di pattern complessi di oscillazione del calcio…
Poster scientifico
Saggi multiplex automatizzati per la valutazione della neurotossicità mediante l’uso di modelli 3D di cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte
Multiplexed automated assays for neurotoxicity evaluation using induced pluripotent stem cell-derived neural 3D cell models
I saggi fenotipici basati su cellule sono diventati un’alternativa sempre più interessante ai tradizionali test in vitro e in vivo nello sviluppo di farmaci e nella valutazione della sicurezza tossicologica…
Poster scientifico
Analisi di eventi complessi per la profilazione neurotossica degli effetti di composti su colture 3D di sferoidi neurali derivati da iPSC umane
Complex event analysis for neurotoxic profiling of compound effects on human iPSC-derived neural spheroid 3D cultures
Per accelerare lo sviluppo di farmaci più efficaci e più sicuri, vi è una crescente necessità di saggi cellulari più complessi, biologicamente rilevanti e con un maggior valore predittivo per la scoperta farmacologica e lo screening tossicologico…
Nota applicativa
Valutazione multiparametrica degli effetti proaritmici indotti dai composti nei cardiomiociti umani derivati da iPSC
Multi-parametric assessment of compound-induced pro-arrhythmic effects in human iPSC-derived cardiomyocytes
Lo sviluppo di saggi di rilevanza biologica, predittivi, basati su cellule, per lo screening dei composti e la valutazione della tossicità rappresenta una delle principali sfide nella scoperta farmacologica.
Poster scientifico
Profilazione della neurotossicità mediante l’uso di sferoidi neurali 3D derivati da iPSC umane
Neurotoxicity profiling using 3D human iPSC-derived neural spheroids
Analisi degli effetti di composti e screening di sostanze chimiche neurotossiche mediante l’uso di sferoidi neurali 3D.
Nota applicativa
Misura dell'oscillazione del calcio in iCell Cardiomyocytes2 sul sistema FLIPR Tetra
Measure Calcium Oscillation in iCell Cardiomyocytes2 on the FLIPR Tetra System
Accorciamento delle sequenze temporali di crescita durante lo screening degli effetti dei composti sui transienti di calcio in cardiomiociti battenti utilizzando il kit iCell® Cardiomyocytes2 (Cellular Dynamics International). iCell…
Poster scientifico
Il kit raziometrico per il calcio Fura-2 QBT, un nuovo saggio omogeneo per la misurazione del flusso di calcio con il sistema FLIPR Tetra e il lettore per micropiastre FlexStation 3
Fura-2 QBT Ratiometric Calcium Kit, a Novel Homogeneous Assay for Measuring Calcium Flux Assays on the FLIPR Tetra System and the FlexStation 3 Microplate Reader
Questo PDF presenta il kit raziometrico per il calcio Fura-2 QBT, che permette di risparmiare tempo e il costo del tampone e assicura meno variabilità tra i pozzetti e una finestra del segnale più ampia.
Nota applicativa
Kit per il calcio Fura-2 QBT: un saggio omogeneo per il calcio basato sul Fura-2
Fura-2 QBT Calcium Kit: A homogenous Fura-2 calcium assay
Il kit per il calcio Fura-2 QBT di Molecular Devices incorpora una comprovata tecnologia basata sul quenching con il Fura-2, un indicatore raziometrico del calcio, per garantire l’omogeneità del saggio in modo da ridurre al minimo la variabilità associata alle cellule…
Nota applicativa
Potenziate i vostri screening del calcio con i kit di saggio del calcio 6 FLIPR
Enhance your calcium screens with FLIPR Calcium 6 Assay Kits
I kit dei saggi per il calcio FLIPR di Molecular Devices impiegano indicatori del calcio sensibili e coloranti di mascheramento brevettati per consentire ai ricercatori di condurre screening in fluorescenza altamente sensibili di…
Nota applicativa
Segnalazione del secondo messaggero GPCR accoppiato a Gi e a Gs in cellule vive sul sistema FLIPR Tetra
Live cell Gi- and Gs -coupled GPCR second messenger signaling on the FLIPR Tetra System
In questo protocollo applicativo dimostriamo l'utilizzo del saggio per il cAMP Promega GloSensor™ basato su luciferasi di lucciola luminescente modificata sul sistema di screening cellulare ad alto rendimento FLIPR Tetra®…
Nota applicativa
Soluzione omogenea per i saggi di GPCR con il kit di saggio del calcio 5 FLIPR
Homogeneous solution for GPCR assays with FLIPR Calcium 5 Assay Kit
Combinando un nuovo fluoroforo e una tecnologia di mascheramento consolidata, il kit di saggio del calcio 5 FLIPR offre una farmacologia affidabile, una finestra di segnale più ampia e un miglioramento del rendimento del saggio. Con il…
Nota applicativa
Saggi di cardiotossicità ad alto rendimento usando cardiomiociti derivati da cellule staminali
High throughput cardiotoxicity assays using stem cell-derived cardiomyocytes
Eliminate i composti cardiotossici e identificate potenziali farmaci candidati per il cuore in una fase più precoce nel processo di scoperta farmacologica con il sistema FLIPR Tetra in combinazione con il software ScreenWorks Peak Pro…
Nota applicativa
Confronto delle misurazioni del calcio intracellulare con i kit di saggio del calcio FLIPR
Comparison of intracellular calcium measurements with FLIPR Calcium Assay Kit
Il sistema FLIPR Tetra fornisce una piattaforma di screening per indagare i saggi basati su cellule con cinetica in tempo reale nel formato a 96, 384 e 1536 pozzetti. Indipendentemente dalla piastra del sistema FLIPR Tetra…
Nota applicativa
Effetti dei composti sui transienti di calcio in cardiomiociti umani derivati da cellule iPSC Cor.4U battenti di Axiogenesis
Compound effects upon calcium transients in beating Axiogenesis Cor.4U human iPS cell-derived cardiomyocytes
La valutazione della cardiotossicità è rilevante negli stadi precoci della scoperta farmacologica per consentire l'eliminazione di composti potenzialmente tossici dall'ulteriore sviluppo. Ciò è critico per ridurre…
Nota applicativa
Monitoraggio dell’attivazione dei recettori accoppiati a proteina Gq sul lettore SpectraMax i3x con modulo di iniezione
Monitoring Gq protein-coupled receptor activation on the SpectraMax i3x reader with injector module
L’attivazione dei recettori accoppiati a proteina Gq viene comunemente monitorata in tempo reale nelle cellule vive utilizzando coloranti sensibili al calcio su un lettore di fluorescenza per piastre. La gestione automatizzata dei liquidi nel…
Nota applicativa
Saggio cinetico su cellule vive mediante l’uso del sistema ImageXpress Micro
Live cell kinetics assay utilizing the ImageXpress Micro System
Il sistema di imaging ad alto contenuto in campo largo ImageXpress® Micro Confocal/XLS di Molecular Devices include moduli opzionali di fluidica e controllo ambientale, che permettono il pipettamento monocanale…
Poster scientifico
Saggi basati su cellule sul sistema FLIPR® Tetra: Confronto tra un innovativo saggio del calcio FLIPR® e altri saggi del calcio basati sulla fluorescenza
Cell Based Assays on the FLIPR® Tetra System: Comparison of a Novel FLIPR® Calcium Assay to other Fluorescence based Calcium Flux Assays
Saggi basati su cellule sul sistema FLIPR Tetra per confrontare un nuovo saggio per il calcio FLIPR 6 e 6-QF rispetto ad altri saggi del flusso di calcio basati sulla fluorescenza.