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Monoclonalità

Documentazione della monoclonalità: un parametro importante a fini regolatori per le linee cellulari per uso terapeutico

Cos’è la monoclonalità?

La monoclonalità è un termine che descrive una linea cellulare che ha origine da un singolo progenitore (una singola cellula) e pertanto è monoclonale. Lo sviluppo di linee cellulari e la verifica della monoclonalità sono fasi cruciali nel processo di generazione di molecole biofarmaceutiche, come gli anticorpi monoclonali. In seguito all’isolamento di una singola cellula vitale che esprime in maniera robusta la proteina di interesse, può essere sviluppata una linea cellulare. Una tappa fondamentale in questo processo è la documentazione delle evidenze di clonalità per garantire la riproducibilità genetica della linea cellulare.

Generalmente, la documentazione della monoclonalità è un parametro importante a fini regolatori per le linee cellulari per uso terapeutico ed è basata su immagini, per cui prevede l’acquisizione di un’immagine di una singola cellula da includere nella presentazione di richieste alle autorità regolatorie.

Verifica della monoclonalità: visualizzazione dell’origine di una colonia

Verifica della monoclonalità: visualizzazione dell’origine di una colonia. La cronologia (delle immagini) della crescita di ciascun pozzetto può essere seguita a ritroso fino al momento iniziale, fornendo evidenze della monoclonalità

Perché è importante la monoclonalità?

Con la crescente rigorosità delle disposizioni in materia di sviluppo di linee cellulari, i ricercatori saranno tenuti a eseguire il clonaggio di singole cellule e fornire evidenze che una linea cellulare è derivata da una singola cellula, la cosiddetta prova di clonalità. Nei metodi di clonaggio tradizionali (ad es. diluizione limite e FACS) viene utilizzata l’analisi statistica per determinare un livello di confidenza per la monoclonalità. Tuttavia, la documentazione della monoclonalità ha determinato la necessità di tecnologie e metodologie più solide nel campo dei bioprocessi. Attualmente, molti ricercatori utilizzano routinariamente sistemi di imaging, come l’imager CloneSelect, per verificare la monoclonalità e monitorare la crescita delle cellule nei terreni di coltura cellulare.

Elevata garanzia di monoclonalità per lo sviluppo di linee cellulari

Lo sviluppo di linee cellulari che esprimono una specifica proteina di interesse è cruciale per la generazione di farmaci biologici e le agenzie regolatorie richiedono evidenze della monoclonalità affinché un farmaco biologico possa essere immesso sul mercato. L’approccio tradizionale prevede la visualizzazione dei pozzetti in luce bianca trasmessa il giorno 0 per confermare la presenza di una singola cellula. Tuttavia, questo approccio non è privo di difficoltà, poiché detriti cellulari e artefatti nei pozzetti possono essere facilmente scambiati per cellule. Di conseguenza, i ricercatori che si occupano dello sviluppo di linee cellulari valutano solitamente le cellule allo stato di colonia e risalgono alle origini della colonia per confermare la monoclonalità.

Il flusso di lavoro evidenzia il processo attraverso il quale il sistema di imaging CloneSelect permette di verificare la monoclonalità in base a un’analisi obiettiva delle immagini. In combinazione con il CloneSelect Single-Cell Printer per la separazione di singole cellule, questo sistema migliora il flusso di lavoro grazie a un aumento della crescita clonale e a un’ulteriore garanzia di monoclonalità basata su immagini.

Flusso di lavoro per la monoclonalità
  1. Separazione di singole cellule in pozzetti di micropiastre – Occorre isolare e clonare singole cellule vitali per assicurarsi che la popolazione cellulare sia geneticamente identica e ridurre significativamente l’eterogeneità dell’espressione.

  2. Scansione della piastra in luce bianca al giorno 0 e nei giorni successivi – Acquisire immagini della piastra al giorno 0 e nei giorni successivi. Generalmente, la documentazione della monoclonalità (un parametro importante a fini regolatori per le linee cellulari per uso terapeutico) è basata su immagini, per cui prevede l’acquisizione di un’immagine di una singola cellula da includere nella presentazione di richieste alle autorità regolatorie.

  3. Analisi della scansione della piastra e valutazione della crescita generale (luce bianca) – Rivedere e analizzare le immagini monitorando i tassi di crescita cellulare, le misurazioni della confluenza e la formazione di colonie.

  4. Conferma della monoclonalità ed esportazione dei dati dei pozzetti per la presentazione alle autorità regolatorie – Confermare la monoclonalità ed esportare i dati dei pozzetti in un rapporto dettagliato per la presentazione alle autorità regolatorie.

Miglioramento della crescita clonale mediante un separatore di singole cellule

Gli strumenti della serie CloneSelect Single-Cell Printer sono sistemi totalmente automatizzati che utilizzano una tecnologia brevettata basata sulla microfluidica e l’analisi delle immagini in tempo reale per separare e dispensare singole cellule in micropiastre standard, fornendo allo stesso tempo la garanzia di monoclonalità mediante la documentazione delle immagini. Questi sistemi permettono di sopperire agli inconvenienti associati alla separazione delle cellule tramite diluizione limite e citometria a flusso offrendo evidenze di clonalità basate su immagini, una dispensazione rapida ed efficiente di singole cellule mediante imaging in luce bianca (sistemi c. sight e f. sight) o in fluorescenza (opzionale, solo sistemi f. sight), un’eccellente crescita dopo la dispensazione, rischi di contaminazione crociata minimi e costi di manutenzione estremamente bassi. In combinazione con l’imager CloneSelect, gli strumenti della serie Single-Cell Printer assicurano un miglioramento di entrambi questi flussi di lavoro permettendo di ottenere un aumento della crescita clonale e maggiori garanzie di monoclonalità basate su immagini.

Miglioramento della crescita clonale mediante un separatore di singole cellule

Tecnologia del CloneSelect Single-Cell Printer (SCP)(A) Dopo che in una cartuccia viene caricato un campione contenente cellule, la cartuccia viene montata sull’SCP e viene avviata una sessione di dispensazione. Durante la procedura di dispensazione, un attuatore piezoelettrico genera continuamente goccioline in una sequenza prevedibile. Le goccioline che non contengono cellule o che contengono più di una cellula vengono risucchiate via mediante un meccanismo di aspirazione situato direttamente sotto l’ugello. Quando vengono identificati eventi di presenza di una singola cellula, un otturatore inibisce il meccanismo di aspirazione permettendo alla gocciolina contenente la singola cellula di cadere nel pozzetto. (B) Quando viene rilevato un evento di presenza di una singola cellula, vengono acquisite cinque immagini per fornire evidenze della clonalità in corrispondenza dell’ugello. Le immagini 1-3 mostrano la presenza di una cellula prima dell’eiezione della gocciolina, l’immagine 4 inquadra la regione contenente la singola cellula e l’immagine 5 mostra l’ugello dopo l’eiezione della gocciolina.

Imaging della micropiastra, caratterizzazione dei cloni e generazione del rapporto Imaging della micropiastra, caratterizzazione dei cloni e generazione del rapporto

(A) Immagini al giorno 10 dei cloni derivati dalla sessione di dispensazione dall’SCP. La scheda Plate Thumbnails (Anteprime piastra) permette di visualizzare le colonie. Facendo clic sui singoli pozzetti, l’utente può passare alla scheda View Image (Visualizza immagine), in cui è mostrata un’immagine dell’intero pozzetto. (B) La scheda Loci Count (Conteggio loci) permette di contare le colonie. Questo processo può essere ottimizzato regolando l’area e la compattezza, una misura della rotondità, di una colonia. (C) Nella scheda Generate Report (Genera rapporto), le regioni contenenti cellule (riquadri verdi) possono essere definite e rettificate per ciascun punto temporale in una serie per caratterizzare la crescita da una singola cellula a una colonia.

Quali colonie sono monoclonali e quali no

Utilizzando il software dell’imager CloneSelect per ingrandire le singole colonie immobilizzate, è possibile monitorare la crescita e determinare se una colonia è monoclonale esaminando le immagini di quella colonia ottenute in punti temporali diversi. Nella figura qui di seguito sono mostrate le immagini di due colonie. Osservando la crescita delle due colonie e seguendo le immagini a ritroso fino al giorno 0, è possibile determinare se la colonia ha avuto origine da una o più cellule. Le microsfere (mostrate nei cerchietti gialli) aggiunte nel terreno semisolido servono come riferimento di posizione per confermare che le immagini sono relative sempre alla stessa colonia.

Colonia monoclonale derivata da una singola cellula

Crescita di cellule CHO-s in terreno semisolido CloneMedia CHO Growth A È stato utilizzato l’imager CloneSelect per acquisire immagini delle piastre a 6 pozzetti in punti temporali diversi. Al giorno 0 è possibile osservare chiaramente che è presente una sola cellula nella fila superiore, mentre nella fila inferiore sono visibili due cellule. Il cerchietto giallo mostra la posizione di una microsfera che serve come riferimento di posizione per confermare che le immagini acquisite in tempi diversi sono relative sempre alla stessa colonia.

Ottenimento di evidenze di monoclonalità basate su immagini (rapporto)

Ottenere evidenze della monoclonalità basate su immagini nel processo di sviluppo di linee cellulari non è così semplice come esportare un’immagine di una singola cellula. Ad esempio, occorre anche ispezionare immagini ad alta risoluzione dell’intero pozzetto per garantire che non sia presente una seconda cellula.

Con pochi semplici clic, la funzione Rapporto sulla monoclonalità disponibile sull’imager CloneSelect™ (CSI) permette di organizzare in maniera obiettiva le evidenze giustificative basate su immagini necessarie per stabilire la clonalità in un rapporto facilmente condivisibile, consentendo ai ricercatori di risparmiare le ore di lavoro generalmente richieste per eseguire lo stesso processo manualmente.

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Verifica della monoclonalità

Metodi per garantire la monoclonalità

Scoprite di più sui diversi metodi per verificare e documentare la monoclonalità.

  • Garanzia di clonalità affidabile mediante l’uso di calceina AM

    Garanzia di clonalità affidabile mediante l’uso di calceina AM

    Garanzia di clonalità affidabile mediante l’uso di calceina AM con effetti minimi sulla vitalità

    Qui è presentato un flusso di lavoro ottimizzato basato sull’uso del reagente fluorescente calceina AM in combinazione con un modello dell’imager CloneSelect™ provvisto di funzionalità per la fluorescenza, che mostra una vitalità simile a quella ottenuta in condizioni senza marcatura, fornendo allo stesso tempo elevate garanzie di clonalità.

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    eBook: Ottimizzazione delle linee cellulari di valore elevato

    Ottimizzazione delle linee cellulari di valore elevato

    In questo eBook, presentiamo una panoramica del flusso di lavoro per lo sviluppo di linee cellulari nonché soluzioni ad alto rendimento per accelerare il processo e per facilitare e velocizzare la selezione di linee di cellule di mammifero altamente produttive.

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  • Metodo a fluorescenza per l’identificazione di cellule CHO-S monoclonali

    Metodo a fluorescenza per l’identificazione di cellule CHO-S monoclonali

    Metodi rapidi di verifica della monoclonalità per velocizzare lo sviluppo di linee cellulari

    Anche se è possibile procedere alla verifica della monoclonalità mediante imaging in luce bianca, la presenza di detriti, polvere e bolle d’aria rende l’identificazione di singole cellule difficile e laboriosa, con il conseguente rischio di scartare cloni di valore elevato. Qui presentiamo un metodo a fluorescenza per l’identificazione di cellule CHO-S monoclonali mediante l’uso del colorante CellTracker Green CMFDA.

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    Elevata garanzia di monoclonalità per lo sviluppo di linee cellulari

    Elevata garanzia di monoclonalità per lo sviluppo di linee cellulari

    Per la semina di singole cellule in un pozzetto vengono solitamente utilizzate la diluizione limite o la separazione cellulare attivata da fluorescenza. Vengono poi adoperate tecniche di microscopia per determinare il numero di cellule seminate in ciascun pozzetto e monitorare la loro crescita. Anche se è possibile procedere alla verifica della monoclonalità mediante imaging in luce bianca, la presenza di detriti, polvere e bolle d’aria rende l’identificazione di singole cellule difficile e laboriosa, con il conseguente rischio di scartare cloni di valore elevato

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  • Identificazione di cellule CHO-S monoclonali coltivate in terreno semisolido

    Identificazione di cellule CHO-S monoclonali coltivate in terreno semisolido

    Identificazione affidabile di cellule CHO-S monoclonali coltivate in terreno semisolido

    La crescita delle cellule CHO in terreno CloneMedia CHO Growth A è un metodo di clonaggio di tali cellule più efficiente rispetto alla diluizione limite in terreno liquido. Il terreno semisolido immobilizza le cellule, evitando che esse si muovano durante il trattamento di routine. Ciò consente ai ricercatori di monitorare in maniera affidabile la crescita di una singola cellula fino alla formazione di una colonia.

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    Miglioramento dell’efficienza di clonaggio con maggiori garanzie di clonalità

    Miglioramento dell’efficienza di clonaggio con maggiori garanzie di clonalità

    Un flusso di lavoro che combina l’isolamento di singole cellule e l’imaging delle micropiastre migliora l’efficienza di clonaggio offrendo maggiori garanzie di clonalità

    Un flusso di lavoro ottimizzato permette di risparmiare tempo e lavoro e di ridurre i costi associati a reagenti e materiali di consumo, aumentando allo stesso tempo l’efficienza di crescita e fornendo maggiori garanzie di clonalità e documentazione rapida pronta per l’uso nella presentazione di richieste alle autorità regolatorie.

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  • Rapporto sulla monoclonalità

    Funzione Rapporto sulla monoclonalità dell’imager CloneSelect

    Funzione Rapporto sulla monoclonalità dell’imager CloneSelect

    Con pochi semplici clic, la funzione Rapporto sulla monoclonalità disponibile sull’imager CloneSelect permette di organizzare in maniera obiettiva le evidenze giustificative basate su immagini necessarie per stabilire la clonalità in un rapporto facilmente condivisibile, consentendo ai ricercatori di risparmiare le ore di lavoro generalmente richieste per eseguire lo stesso processo manualmente.

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    Semplificazione dello screening e della selezione di linee di cellule di mammifero

    Semplificazione dello screening e della selezione di linee di cellule di mammifero

    Uso del sistema ClonePix per valutare la monoclonalità

    Il sistema ClonePix è un potente strumento per il rapido screening e isolamento di linee di cellule di mammifero secretorie tipicamente utilizzate nella produzione di proteine per uso terapeutico e di anticorpi monoclonali per la ricerca. I dati presentati in questo tutorial supportano l’idea che il prelievo di colonie di cellule di mammifero da terreno semisolido è un metodo efficace per isolare linee cellulari clonali.

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Ultime risorse

Risorse per la monoclonalità

Video e webinar

Suggerimenti per l’automazione delle applicazioni di clonaggio molecolare e ingegnerizzazione di ceppi

Flusso di lavoro per la monoclonalità

Flusso di lavoro per la monoclonalità