Monoclonalità
Documentazione della monoclonalità: un parametro importante a fini regolatori per le linee cellulari per uso terapeutico
Cos’è la monoclonalità?
La monoclonalità è un termine che descrive una linea cellulare che ha origine da un singolo progenitore (una singola cellula) e pertanto è monoclonale. Lo sviluppo di linee cellulari e la verifica della monoclonalità sono fasi cruciali nel processo di generazione di molecole biofarmaceutiche, come gli anticorpi monoclonali. In seguito all’isolamento di una singola cellula vitale che esprime in maniera robusta la proteina di interesse, può essere sviluppata una linea cellulare. Una tappa fondamentale in questo processo è la documentazione delle evidenze di clonalità per garantire la riproducibilità genetica della linea cellulare.
Generalmente, la documentazione della monoclonalità è un parametro importante a fini regolatori per le linee cellulari per uso terapeutico ed è basata su immagini, per cui prevede l’acquisizione di un’immagine di una singola cellula da includere nella presentazione di richieste alle autorità regolatorie.
Perché è importante la monoclonalità?
Con la crescente rigorosità delle disposizioni in materia di sviluppo di linee cellulari, i ricercatori saranno tenuti a eseguire il clonaggio di singole cellule e fornire evidenze che una linea cellulare è derivata da una singola cellula, la cosiddetta prova di clonalità. Nei metodi di clonaggio tradizionali (ad es. diluizione limite e FACS) viene utilizzata l’analisi statistica per determinare un livello di confidenza per la monoclonalità. Tuttavia, la documentazione della monoclonalità ha determinato la necessità di tecnologie e metodologie più solide nel campo dei bioprocessi. Attualmente, molti ricercatori utilizzano routinariamente sistemi di imaging, come l’imager CloneSelect, per verificare la monoclonalità e monitorare la crescita delle cellule nei terreni di coltura cellulare.
Elevata garanzia di monoclonalità per lo sviluppo di linee cellulari
Lo sviluppo di linee cellulari che esprimono una specifica proteina di interesse è cruciale per la generazione di farmaci biologici e le agenzie regolatorie richiedono evidenze della monoclonalità affinché un farmaco biologico possa essere immesso sul mercato. L’approccio tradizionale prevede la visualizzazione dei pozzetti in luce bianca trasmessa il giorno 0 per confermare la presenza di una singola cellula. Tuttavia, questo approccio non è privo di difficoltà, poiché detriti cellulari e artefatti nei pozzetti possono essere facilmente scambiati per cellule. Di conseguenza, i ricercatori che si occupano dello sviluppo di linee cellulari valutano solitamente le cellule allo stato di colonia e risalgono alle origini della colonia per confermare la monoclonalità.
Il flusso di lavoro evidenzia il processo attraverso il quale il sistema di imaging CloneSelect permette di verificare la monoclonalità in base a un’analisi obiettiva delle immagini. In combinazione con il dispensatore di singole cellule DispenCel per la separazione di singole cellule, questo sistema migliora il flusso di lavoro grazie a un aumento della crescita clonale e a un’ulteriore garanzia di monoclonalità basata su immagini.
- Smistare le cellule singole nei pozzetti delle micropiastre: occorre isolare e clonare singole cellule vitali per assicurarsi che la popolazione cellulare sia geneticamente identica e ridurre significativamente l’eterogeneità dell’espressione.
- Scansionare la piastra WL al Giorno 0 e nei giorni successivi: eseguire l’imaging della piastra al Giorno 0 e nei giorni successivi. Generalmente, la documentazione della monoclonalità (un parametro importante a fini regolatori per le linee cellulari per uso terapeutico) è basata su immagini, per cui prevede l’acquisizione di un’immagine di una singola cellula da includere nella presentazione di richieste alle autorità regolatorie.
- Esaminare la scansione della piastra e valutare la crescita complessiva (WL) : esaminare e analizzare le immagini monitorando i tassi di crescita cellulare, le misurazioni della confluenza e la formazione di colonie.
- Confermare la monoclonalità ed esportare i dati del pozzetto per la domanda normativa: confermare la monoclonalità ed esportare i dati del pozzetto in un report dettagliato per la domanda normativa.
Miglioramento della crescita clonale mediante la dispensazione di singole cellule
L’unità di dispensazione di singole cellule di DispenCell è dotata di un puntale sensibile che rileva il passaggio delle cellule. Quando ogni cellula avanza, si attiva un segnale elettrico specifico. La traccia elettrica univoca viene registrata immediatamente, consentendo all’utente di controllarne la clonalità in modo immediato una volta dispensate le cellule.
La tecnologia è basata sull’impedenza e quindi estremamente delicata con le cellule, preservandone la vitalità e l’integrità per una crescita ottimale. DispenCell utilizza un puntale di rilevamento sterile monouso (DispenTip) per rilevare e registrare il passaggio di ogni cellula che attraversa l’apertura del DispenTip. Con il passaggio della singola cellula attraverso l’apertura per poi finire nel pozzetto, lascia un segnale elettrico che appare come picco univoco, mentre le cellule doppiette o multiple lasciano picchi multipli.
Rappresentazione grafica delle informazioni di picco prodotte dal dispensatore di due pozzetti accanto alle loro immagini da CSI-FL. Uno con un singolo picco e una cellula (in alto) e uno con un doppio picco e due cellule (in basso). La singola cellula si è sviluppata in una colonia e il suo rapporto sulla monoclonalità è stato generato utilizzando la funzione di rapporto sulla monoclonalità di CSI-FL.
Quali colonie sono monoclonali e quali no
Utilizzando il software dell’imager CloneSelect per ingrandire le singole colonie immobilizzate, è possibile monitorare la crescita e determinare se una colonia è monoclonale esaminando le immagini di quella colonia ottenute in punti temporali diversi. Nella figura qui di seguito sono mostrate le immagini di due colonie. Osservando la crescita delle due colonie e seguendo le immagini a ritroso fino al giorno 0, è possibile determinare se la colonia ha avuto origine da una o più cellule. Le microsfere (mostrate nei cerchietti gialli) aggiunte nel terreno semisolido servono come riferimento di posizione per confermare che le immagini sono relative sempre alla stessa colonia.
Crescita di cellule CHO-s in terreno semisolido CloneMedia CHO Growth A È stato utilizzato l’imager CloneSelect per acquisire immagini delle piastre a 6 pozzetti in punti temporali diversi. Al giorno 0 è possibile osservare chiaramente che è presente una sola cellula nella fila superiore, mentre nella fila inferiore sono visibili due cellule. Il cerchietto giallo mostra la posizione di una microsfera che serve come riferimento di posizione per confermare che le immagini acquisite in tempi diversi sono relative sempre alla stessa colonia.
Ottenimento di evidenze di monoclonalità basate su immagini (rapporto)
Ottenere evidenze della monoclonalità basate su immagini nel processo di sviluppo di linee cellulari non è così semplice come esportare un’immagine di una singola cellula. Ad esempio, occorre anche ispezionare immagini ad alta risoluzione dell’intero pozzetto per garantire che non sia presente una seconda cellula.
Con pochi semplici clic, la funzione Rapporto sulla monoclonalità disponibile sull’imager CloneSelect™ (CSI) permette di organizzare in maniera obiettiva le evidenze giustificative basate su immagini necessarie per stabilire la clonalità in un rapporto facilmente condivisibile, consentendo ai ricercatori di risparmiare le ore di lavoro generalmente richieste per eseguire lo stesso processo manualmente.
Metodi per garantire la monoclonalità
Scoprite di più sui diversi metodi per verificare e documentare la monoclonalità.