Plasmidi AAV
Che cosa sono i plasmidi AAV?
L’AAV (Virus Adeno-Associato), un virus minuto prevalente nella produzione biologica, è preferito per la sua replicazione limitata e la ridotta immunogenicità per l’uomo. La produzione di vettori virali di alto livello per il trasferimento genico richiede un processo di bioproduzione complesso, che comprende la produzione di DNA plasmidico e altre fasi complesse.
Flusso di lavoro per la produzione di plasmidi AAV
- Coltura cellulare: Realizzazione del vettore AAV a DNA ed espansione del plasmide. Preparazione e amplificazione di plasmidi che codificano tutti i fattori necessari per generare particelle AAV ricombinanti.
- Adattare le condizioni della cultura: Ottimizzare i sistemi di coltura in sospensione o aderenti, compresi i formati 3D o 2D, a seconda dei requisiti di processo.
- Produzione di vettori AAV: Introdurre il DNA del vettore AAV nelle cellule in modo transitorio o stabilire linee cellulari stabili per 2-3 giorni di replicazione ed espressione.
- Recupero dell’AAV: Filtrare e centrifugare il terreno di coltura cellulare per rimuovere i detriti, concentrando i vettori AAV. Per un’ulteriore purificazione può essere utilizzata la filtrazione a flusso tangenziale (Tangential Flow Filtration, TFF). L’acquisizione e il recupero delle particelle AAV dai mezzi di coltura cellulare o dal lisato seguono le tecniche standard utilizzate per le proteine ricombinanti, tra cui la precipitazione, la centrifugazione, la cromatografia e la filtrazione a flusso tangenziale.
- Purificazione dell’AAV: Utilizzare l’ultracentrifugazione e la cromatografia, come quella di affinità o a scambio ionico, per ottenere preparazioni di vettori AAV ad alta purezza. Mantenere il controllo della qualità durante tutto il processo.
- Titolazione dell’AAV: L’analisi quantitativa e qualitativa del vettore AAV per identificare il titolo più alto può essere eseguita secondo le tecniche standard, compresa la PCR in tempo reale.
- Trasduzione di cellule di mammifero: Le particelle AAV purificate possono essere utilizzate per la trasduzione di linee cellulari di mammifero target, comprese le IPSC, gli organoidi 3D e la terapia con cellule CAR-T.
- Screening e selezione di cloni: Per identificare i cloni trasdotti con successo è necessario uno screening clonale. La selezione di cloni di alto valore e l’arricchimento del pool possono essere eseguiti con metodi automatizzati ad alto rendimento
- Risoluzione dell’eterogeneità e isolamento di cellule singole: L’eterogeneità del pool clonale è stata risolta con tecniche di isolamento di singole cellule e un’analisi basata su immagini, garantendo l’evidenza della monoclonalità della linea cellulare trasdotta con AAV.
- Espansione e caratterizzazione: La caratterizzazione a valle della linea cellulare target può essere eseguita mediante soluzioni automatizzate di imaging ad alto contenuto e test ELISA.
Soluzioni innovative per ottimizzare il flusso di lavoro per la produzione di plasmidi AAV
In Molecular Devices siamo consapevoli delle complessità della produzione di plasmidi AAV. La nostra suite di soluzioni tecnologiche avanzate è meticolosamente progettata per supportare e ottimizzare ogni fase del vostro flusso di lavoro. Con un’attenzione particolare alla precisione, all’efficienza e all'ampliamento, il nostro impegno è quello di promuovere l’eccellenza in ogni fase del processo di produzione dei plasmidi AAV, garantendo risultati da leader nel settore alla vostra azienda.
Sistemi di prelievo di colonie microbiche QPix™
Applicazione nel flusso di lavoro AAV:
- Utilizzato nella fase di realizzazione del vettore AAV a DNA e di espansione del plasmide.
- Preleva in modo efficiente le colonie contenenti i costrutti plasmidici desiderati.
- Può essere utilizzato per selezionare colonie con fenotipi specifici, assicurando la selezione del giusto costrutto plasmidico.
Funzioni:
- Preleva fino a 3.000 colonie all’ora.
- Supporta una vasta gamma di microrganismi e modalità di selezione.
- Garantisce la sterilità con la sanificazione a luce UV e il lavaggio dei puntali.
- Offre diverse modalità di imaging per una selezione precisa delle colonie.
- Offre funzionalità automatizzate di semina in piastre e striatura.
- Opzioni di automazione ampliabili per esigenze di produttività variabili.
Sistema di prelievo di colonie di cellule di mammifero ClonePix™
Applicazione nel flusso di lavoro AAV:
- Utilizzato nella fase di screening e selezione di cloni.
- Esamina e seleziona cloni di elevato valore in base alla produttività delle proteine e ad altri attributi.
Funzioni:
- Sistema automatizzato per la selezione di cloni di elevato valore.
- Aumenta la probabilità di trovare linee cellulari ottimali.
- Offre diversi metodi di rilevamento, tra cui la fluorescenza.
- Mantiene la sterilità con luce UV e lavaggio dei puntali.
- Utilizza terreni semisolidi per la formazione di colonie discrete.
Imager CloneSelect™ FL
Applicazione nel flusso di lavoro AAV:
- Utilizzato nella fase di espansione e caratterizzazione.
- Consente l’imaging e l’analisi di cellule di mammifero, garantendo la monoclonalità.
- Può essere utilizzato per verificare gli editing genetici.
Funzioni:
- Consente l’imaging sia in luce bianca che a fluorescenza.
- Genera l’analisi automatica delle confluenze e la garanzia di monoclonalità.
- Tempistiche di acquisizione rapide, con la possibilità di acquisire immagini di una piastra a 96 pozzetti in meno di due minuti.
- Compatibile con vari tipi di cellule, tra cui CHO, HEK e iPSC.
- Offre immagini ad alta risoluzione e analisi intelligenti.
Dispensatore di singole cellule DispenCell™
Applicazione nel flusso di lavoro AAV:
- Utilizzato nella risoluzione dell’eterogeneità e nella fase di isolamento di singole cellule.
- Dispensa singole cellule garantendo la monoclonalità della linea cellulare AAV trasdotta.
Funzioni:
- Fornisce una prova di clonalità immediata e tracciabile.
- La manipolazione delicata preserva la vitalità cellulare.
- Il design compatto si adatta a diversi ambienti di laboratorio.
- Utilizza un puntale monouso per evitare la contaminazione incrociata.
- Interfaccia intuitiva senza necessità di calibrazione.