Rilevazione, quantificazione e analisi delle proteine

eBook: Quantificazione di acidi nucleici e proteine

Ottimizzazione dei saggi in assorbanza per la quantificazione delle proteine e degli acidi nucleici

I lettori per micropiastre in assorbanza sono ampiamente utilizzati nella ricerca di base, nella scoperta farmacologica, nella validazione dei saggi biologici, nel controllo di qualità e nei processi di produzione nell'industria farmaceutica, biotecnologica, degli alimenti e delle bevande, e in campo accademico. Questi lettori permettono di eseguire misurazioni rapide e sensibili su una varietà di analiti in un ampio intervallo di concentrazioni per un vasto assortimento di saggi, tra cui ELISA, crescita microbica, rilevazione di componenti e contaminanti chiave e quantificazione delle proteine.

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ELISA

I saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) si usano per misurare la quantità di una specifica proteina, tramite un formato a micropiastre, e nei casi più frequenti i risultati vengono rilevati con l'assorbanza nell'intervallo di lunghezze d'onda del visibile. I formati ELISA chemioluminescenti e fluorescenti offrono un aumento della sensibilità per una quantificazione accurata degli analiti meno abbondanti.

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Applicazioni delle proteine fluorescenti

Le proteine dentro le cellule eucariotiche esistono in uno stato dinamico, in un equilibrio altamente regolato tra sintesi e degradazione. Benché la sintesi proteica sia ben compresa dopo decenni di studio, i principali progressi nella conoscenza della degradazione delle proteine si sono verificati solo nel corso degli ultimi due decenni. È possibile utilizzare proteine fluorescenti come reporter per studiare la degradazione proteica e le vie di segnalazione cellulare correlate.

Leggete le nostre note applicative per scoprire come sono stati utilizzati i sensori proteosomici fluorescenti.

• Reporter fluorescenti e chemiluminescenti multiplex per cellule vive per dissecare i requisiti della trasduzione del segnale di NFkB
• Misurazione dell'inibizione del proteosoma in cellule vive sui lettori per micropiastre Analyst® GT, FLEXstation® e Gemini EM usando il sensore per proteosoma di BD Biosciences

Quantificazione delle IgG

La misurazione accurata e affidabile del titolo degli anticorpi monoclonali (ad es. IgG) è essenziale nello sviluppo e nella successiva produzione di numerosi farmaci biologici. Il saggio Valita®TITER permette di misurare concentrazioni di IgG comprese tra 2,5 e 100 mg/l o 100 e 2000 mg/l, utilizzando un formato “mix-and-read” ad alto rendimento con letture di polarizzazione della fluorescenza (PF). I lettori per micropiastre multimodali SpectraMax con modalità di rilevazione della PF sono stati validati per l’uso con i saggi ValitaTITER. Per informazioni sulle impostazioni ottimizzate per ciascun lettore, leggete la nostra nota applicativa:

• Piattaforma di quantificazione delle IgG ad alto rendimento per lo screening di cloni nelle attività di scoperta e sviluppo di farmaci

Misurazione della concentrazione delle proteine (Bradford, BCA, ecc.)

La concentrazione proteica può essere misurata per via diretta, attraverso l'assorbanza a 280 nm in uno spettrofotometro a UV, oppure indirettamente, usando metodi colorimetrici come per esempio i saggi BCA o di Bradford. Le proteine possono anche essere quantificate mediante metodi fluorimetrici.

Di seguito trovate alcune note applicative sulla quantificazione delle proteine che potrebbero essere di vostro interesse:

• Ottimizzate la quantificazione delle proteine basata su BCA sul lettore SpectraMax iD5
• Misurate le proteine totali nei lisati cellulari con il lettore per micropiastre SpectraMax ABS Plus
• Quantificazione delle proteine con il lettore per micropiastre EMax Plus
• Quantificazione diretta delle proteine usando la micropiastra per microvolumi SpectraDrop
• Utilizzo del kit per le proteine NanoOrange con i lettori per micropiastre SpectraMax

Rilevazione del triptofano

La fluorescenza intrinseca delle proteine si deve agli amminoacidi aromatici triptofano, tirosina e fenilalanina. Il triptofano domina l'emissione delle proteine ed è il più sensibile alla polarità del solvente e all'ambiente locale. L'analisi delle variazioni di fluorescenza del triptofano può restituire informazioni sulla denaturazione e conformazione delle proteine.

In queste note applicative dimostriamo il rendimento dei lettori per piastre multimodali SpectraMax® per saggi in cui viene misurata la fluorescenza intrinseca del triptofano.

• Misurate la fluorescenza intrinseca del triptofano sul lettore per micropiastre SpectraMax iD3
• Rilevazione intrinseca del triptofano con la piattaforma per micropiastre multimodale SpectraMax i3

Western blot

Il western blot è una tecnica diffusa utilizzata per la rilevazione e la quantificazione delle proteine. Scoprite le varie tecniche utilizzate per rilevare le proteine sulle membrane dei western blot, tra cui le tecniche colorimetriche, in fluorescenza e in chemiluminescenza. Sarà illustrato anche un innovativo sistema di rilevazione dei western blot, il primo nel suo genere, su un lettore per micropiastre multimodale.

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