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Un gruppo di ricercatori ottiene nuove informazioni sulla risposta immunitaria durante le infezioni respiratorie pediatriche utilizzando il sistema ImageXpress Pico

“Il sistema ImageXpress Pico ha consentito al nostro team di valutare in maniera accurata ed efficiente le caratteristiche di legame dei mastociti agli HLF infettati da RSV e di comprendere meglio la risposta infiammatoria all’RSV.”

Seattle Children’s Hospital, Seattle Children’s Research

Institute, Università di Washington, Benaroya Research Institute

Primo autore: dott. Stephen R. Reeves, Ricercatore

principale presso il Seattle Children’s Research Institute e

medico curante nella Divisione di Medicina Polmonare e

del Sonno presso il Seattle Children’s Hospital

Sistema di imaging cellulare automatizzato ImageXpress Pico

La sfida

Comprensione delle caratteristiche di legame di mastociti e ialuronano nella matrice extracellulare di fibroblasti polmonari umani infettati da RSV

Il virus respiratorio sinciziale (Respiratory Syncytial Virus, RSV) è uno dei virus più comuni che infettano i bambini in tutto il mondo. Nei casi lievi, l’infezione con questo virus provoca l’infiammazione delle sole vie respiratorie superiori (naso e gola); in casi più gravi, l’infezione si spinge fino alle vie respiratorie inferiori (bronchi e polmoni) ed è accompagnata da tosse, lieve febbre e perdita di appetito.

Il dott. Reeves e i suoi collaboratori eseguono un’analisi dell’interazione tra cellule LUVA e MEC di fibroblasti polmonari umani (HLF)

Casi più gravi di infezione da RSV possono evolvere in polmonite, insufficienza respiratoria e/o decesso. L’RSV è altamente contagioso e colpisce prevalentemente i bambini. Tuttavia, sono suscettibili all’infezione anche gli adulti e i soggetti con un sistema immunitario indebolito. I sintomi e la trasmissione dell’RSV sono simili a quelli di altri virus che infettano le vie respiratorie superiori e inferiori, compresi i virus dell’influenza A e B, i rinovirus, gli adenovirus e il ceppo di coronavirus responsabile della COVID-19.

Una comprensione più approfondita dei meccanismi di base di questi virus potrebbe permettere di sviluppare potenziali opzioni terapeutiche. I ricercatori del Seattle Children’s Research Institute, presso l’Università di Washington, e del Benaroya Research Institute hanno deciso di studiare uno di questi potenziali meccanismi dell’RSV.

Il dott. Stephen Reeves e i suoi collaboratori hanno ideato vari esperimenti per determinare gli effetti infiammatori a valle delle interazioni tra mastociti e ialuronano (HA) in fibroblasti polmonari umani (Human Lung Fibroblasts, HLF) infettati da RSV. Era necessario eseguire studi di imaging a fluorescenza sia su cellule vive che fissate per testare una serie di condizioni, tra cui la posizione e il meccanismo di azione dell’HA nella matrice extracellulare (MEC), l’espressione proteica nei mastociti e le interazioni molecolari tra HA, mastociti e MEC. La microscopia a fluorescenza tradizionale richiedeva l’uso di vetrini coprioggetto in vetro per l’imaging delle cellule fissate, con conseguente aumento del tempo di manipolazione e processamento dei tessuti. Il dott. Reeves e il suo team avevano bisogno di un sistema avanzato che fosse in grado di acquisire immagini di alta qualità sia di cellule vive che di tessuto fissato in maniera più efficiente.

La soluzione

Imaging a fluorescenza ad alta risoluzione di cellule vive e fissate e relativa analisi

Il team di ricerca ha scelto il sistema di imaging cellulare automatizzato ImageXpress® Pico per la sua facilità d’uso, flessibilità e solide funzioni analitiche.

Protocolli dei saggi
Per aiutare il team ad avviare rapidamente i suoi esperimenti, i nostri field applications scientist e i nostri specialisti dell’assistenza tecnica hanno offerto formazione e supporto in loco per i diversi saggi. L’intervento ha incluso lo sviluppo di protocolli per i saggi e di analisi immediate in modo che le immagini potessero essere simultaneamente raccolte e analizzate.

Acquisizione delle immagini
Il team di ricerca ha eseguito esperimenti di imaging su cellule vive, dopodiché ha fissato il tessuto per colorare i componenti della matrice extracellulare, che non sono facilmente visualizzabili utilizzando le tecniche per le cellule vive. Il sistema ImageXpress Pico ha permesso ai ricercatori di effettuare tutti gli studi di imaging utilizzando piastre multipozzetto, un approccio che ha ridotto notevolmente il tempo necessario per la manipolazione e il processamento dei campioni. Nell’ambito del processo di acquisizione delle immagini sono state combinate ampie aree di interesse acquisite con obiettivi a maggiore ingrandimento. In tal modo, è stata eliminata la necessità di ulteriori replicati da esaminare mediante microscopia a epifluorescenza tradizionale e sono state ottenute immagini di qualità superiore.

Analisi
Il dott. Reeves e i suoi collaboratori sono stati in grado di eseguire un’analisi quantitativa delle interazioni tra i mastociti (ad es. cellule LUVA) e la MEC degli HLF infettati da RSV. Le immagini e l’analisi dei dati sono riportate di seguito.

Cellule LUVA

Il sistema ImageXpress Pico è stato utilizzato anche per analizzare gli effetti degli HLF infettati da RSV sull’espressione di TSG-6 e sull’adesione dei mastociti (ossia, cellule LUVA) durante un intervallo di tempo di 48 ore.Le immagini e l’analisi dei dati sono riportate di seguito. (Nota: TSG-6 è una proteina associata all’infiammazione e la sua espressione risulta aumentata nelle cellule infettate da RSV).

Cellule infettate da RSV

I risultati

 

Dati di alta qualità permettono di ridurre i tempi delle scoperte scientifiche

Utilizzando il sistema ImageXpress Pico, il team del dott. Reeves è stato il primo a dimostrare che:

  • Negli HLF derivati da donatore pediatrico e infettati da RSV esiste un aumento della sintesi di HA, per cui la MEC presenta un arricchimento di questo componente
  • Una MEC arricchita di HA promuove un’adesione più forte dei mastociti e aumenta il rilascio di proteasi mastocitarie che contribuiscono alla risposta infiammatoria (ad es. restringimento delle vie aeree, produzione di muco, tosse)
  • Gli HLF infettati da RSV presentano una maggiore espressione di mediatori infiammatori da parte dei mastociti, nonché una maggiore adesione di queste cellule

I risultati dello studio indicano che la formazione di una MEC arricchita di HA promuove un ambiente proinfiammatorio durante le infezioni virali acute delle vie respiratorie. Questo meccanismo potrebbe avere implicazioni di ampia portata per gli interventi terapeutici per l’RSV e per altri virus respiratori.

Infezioni di HLF con RSV

Riepilogo dei risultati: lo studio ha dimostrato che l’infezione di HLF con RSV induce la sovraregolazione di enzimi che sintetizzano HA (HAS 2 e 3) e allo stesso tempo riduce l’espressione di enzimi che degradano l’HA (HYAL 2), con conseguente aumento dell’accumulo di HA nella MEC e maggiore adesione dei mastociti. Inoltre, gli HLF infettati da RSV presentano una maggiore espressione di TSG-6, che promuove il legame dei mastociti alla MEC. Nei mastociti legati alla MEC indotta da RSV si verifica un aumento dell’espressione delle proteasi mastocitarie che contribuiscono alla creazione di un ambiente proinfiammatorio.

 

Riferimenti bibliografici

 

Maggiori informazioni sono disponibili sul sito: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6997473/

“Il sistema ImageXpress Pico si evolve costantemente per soddisfare le nostre mutevoli esigenze e apre le porte a nuove scoperte. Non vediamo l’ora di sapere quali saranno i prossimi sviluppi!”

Il dott. Reeves e altri autori corrispondenti sono membri del laboratorio del dott. Jason Debley. Il laboratorio del dott. Debley utilizza metodi epidemiologici, clinici e molecolari per capire l’evoluzione dell’asma nella prima infanzia e studiare il ruolo dell’epitelio delle vie respiratorie nell’asma pediatrica.

I ricercatori che lavorano presso il Center for Immunity and Immunotherapies del Seattle Children’s Research Institute studiano alcune delle più complesse malattie pediatriche che colpiscono il sistema immunitario umano. L’obiettivo finale è quello di utilizzare le potenzialità terapeutiche dell’immunologia per sviluppare nuovi trattamenti per le malattie.