Un caso di studio per gli organoidi derivati da pazienti (Patient-Derived Organoids, PDO) pronti per il saggio e per l’imaging 3D ad alta velocità per la scoperta farmacologica
Introduzione – il problema
Il costo medio di portare un nuovo farmaco in clinica è di circa 1 miliardo di dollari secondo uno studio condotto dalla Scuola di Economia di Londra a marzo 2020 ( www.lse.ac.uk). Ciò è in parte dovuto ai modelli scarsamente rappresentativi utilizzati per lo screening nelle prime fasi della ricerca farmacologica, che hanno portato a un elevato tasso di fallimento dei composti più avanti nella fase di sviluppo dei farmaci. Ciò ha guidato la ricerca di modelli più incentrati sul paziente per una selezione precoce e accurata dei potenziali clienti per un ulteriore sviluppo clinico.
Gli organoidi derivati dal paziente (PDO o semplicemente “organoidi”) cresciuti in tre dimensioni rappresentano una soluzione a questo problema. Si tratta di copie in miniatura del tessuto bioptico umano normale o malato da cui sono derivati e rappresentano completamente i tessuti 3D nel corpo umano. Le prove mostrano che quando i pazienti e i loro organoidi derivati vengono trattati con gli stessi farmaci, mostrano una risposta speculare (Vlachogiannis et al., 2018). Questo dimostra la prova del principio che gli organoidi possono essere utilizzati per lo screening di “librerie” di potenziali agenti terapeutici. I composti che hanno l'effetto desiderato sugli organoidi del paziente sono probabilmente efficaci nel trattare i pazienti stessi.
Che cosa sono gli organoidi derivati dal paziente (PDO)?
- Derivato dal tessuto della biopsia del paziente normale o malato
- Cresciuto in 3D in un gel proteico con alimentazione liquida
- Formato da più tipi di cellule (così come gli organi nel corpo)
- Replicati di organo in miniatura (ad es. “mini guts”)
- Completamente rappresentativo della biologia dell’uomo
- Gli "avatar" brevettati per l'uso nella ricerca di farmaci
- Cresciuto in un bio-processore per creare milioni di copie standardizzate per lotto
Immagine in campo luminoso di 3D, carcinoma colorettale, organoidi derivati dal paziente (PDO)
Idealmente, una volta che i farmaci sono stati adeguatamente testati e autorizzati per l’uso in clinica, i singoli trattamenti farmacologici sarebbero stati progettati per ogni paziente, in base alla risposta dei propri organoidi. Sfortunatamente, per derivare ed espandere gli organoidi attualmente ci vogliono diverse settimane in laboratorio. I medici non desiderano attendere molto prima di iniziare la terapia. La terapia personalizzata potrebbe essere possibile in futuro in quanto la tecnologia per la derivazione, la coltivazione e l’espansione degli organoidi viene ulteriormente affinata e messa a punto.
Gli organoidi 3D sono una tecnologia relativamente nuova e i test per usarli appieno sono ancora in fase di progettazione e sviluppo. I Ricercatori sono più abituati a lavorare con monostrati di celle 2D che sono molto meno complessi, ma non rappresentano con precisione la biologia umano.
La difficoltà - selezione accurata dei composti dalle prime schermate, per ulteriore sviluppo e test clinici
Il test di vitalità è un metodo comune per quantificare l’efficacia del composto (“efficacia”). Una tecnica utilizzata frequentemente è un test basato sulla bioluminescenza che rileva la presenza di cellule attiva dal punto di vista metabolico misurando i livelli di ATP. L’imaging ad alto contenuto può anche essere utilizzato per determinare la vitalità cellulare contando il numero di cellule viventi o morte (etichettate con coloranti come Calcein AM, un marcatore di cellule viventi comune) in un campione trattato con un farmaco rispetto a un controllo non trattato (ed eventualmente organoidi derivati dal tessuto non-cancro). L’effetto desiderato dei farmaci utilizzati nella terapia è quello di uccidere il maggior numero possibile di cellule tumorali, lasciando intatto il tessuto sano. Il numero di cellule ancora viventi nel campione non trattato sarà considerevolmente superiore a quello delle cellule trattate con il farmaco, in particolare quando vengono utilizzate concentrazioni elevate della terapia. È quindi importante quantificare la differenza tra le due condizioni e determinare se i composti anti-cancro come Trametinib hanno efficacia. Lo stesso principio può essere utilizzato per identificare nuovi agenti terapeutici che funzionano in modo efficace per uccidere le cellule del cancro come parte di uno schermo da una libreria di composti.
Non tutti i farmaci agiscono nello stesso modo. Alcuni farmaci agiscono specificamente su un sottoinsieme di cellule target o alterano i segnali all’interno delle cellule per prevenire la ricrescita e la diffusione della malattia. Non vi è alcun effetto di uccisione delle cellule sfuse, quindi le differenze tra le cellule sane e quelle del tumore non sono facilmente distinguibili o quantificabili contando il numero di cellule viventi rimanenti dopo il trattamento. Sono necessarie metodologie alternative.
Gli organoidi del cancro colorettale sono stati lasciati non trattati (A) o esposti a trametinib (5mM) (B). Sono stati colorati dopo 5 giorni per mostrare le cellule viventi (verde, Calcein AM) e le cellule morte (rosso, etidium omodimer). Si può chiaramente vedere che ci sono pochissime cellule viventi rimanenti dopo il trattamento con trametinib.
La soluzione – per rilevare gli effetti sottili dei farmaci che agiscono su target specifici attraverso l’imaging 3D ad alto rendimento
Gli scienziati hanno osservato che il trattamento degli organoidi con i farmaci può causare una marcata modifica dell’aspetto (virfologia) che è collegata all’effetto del farmaco sulle cellule. Oltre alla vitalità, è possibile aggiungere altri marker fluorescenti al campione per ottenere informazioni specifiche sulle cellule e sugli organoidi, come la struttura citoscheletrica, i mitocondri e la morfologia complessiva degli organoidi. L’acquisizione di immagini di organoidi con imaging ad alto contenuto e l’uso di strumenti di analisi dei dati per quantificare le modifiche possono quindi potenzialmente essere utilizzati per indicare quando un composto sconosciuto sta avendo un effetto. Ciò è particolarmente rilevante quando un test a cellule vive/morte non è in grado di rilevare alcuna differenza tra le cellule trattate e non trattate. (Badder et al., 2020).
Esempio di modifiche organolettiche acquisite utilizzando il sistema Micro Confocal di dispositivi Molecolari ImageXpress® . Gli organoidi CRC sono stati fissati colorati con phalloidin (verde), Hoechst (blu) ed etidium homodimer (rosso). Si noti le variazioni nella colorazione della phalloidin (verde) tra i gruppi di controllo e di trattamento
Per dimostrare ulteriormente il principio secondo cui l’imaging 3D degli organoidi può essere utilizzato nella ricerca di nuovi farmaci, Cellesce ha utilizzato l’automazione all’avanguardiadi Molecular Devices, la tecnologia di diagnostica per immagini e l’analisi avanzata dei set di dati di diagnostica per immagini 3D per confrontare le caratteristiche fisiche degli organoidi del tumore colorettale non trattato e trattato con il farmaco. Per analizzare le immagini CRC sono stati utilizzati strumenti di analisi delle immagini basati sull’intelligence artificiale e vari descrittori fenotipici sono stati utilizzati per quantificare gli effetti del trattamento. Di seguito viene mostrato un esempio di una delle misurazioni che è possibile effettuare, ovvero l’area totale.
Immagini di organoidi catturate su ImageXpress Confocal. L’imaging in campo chiaro viene utilizzato per monitorare le variazioni nella morfologia degli organoidi nel tempo. L'analisi viene eseguita nel software di analisi delle immagini IN Carta. Ogni organoide identificato è sovrapposto con una maschera colorata. Il grafico (E) mostra la variazione nell'area media degli organoidi in 5 giorni.
La maggiore riduzione dell’area totale è osservata negli organoidi trattati con i farmaci romidepsin e trametinib. In confronto al controllo, il trattamento con romidepsin e trametinib ha arrestato la crescita degli organoidi. Questo risultato è coerente con i dati del test di vitalità, in cui gli organoidi trattati con romidepsin e trametinib mostrano un aumento significativo delle cellule morte (come percentuale del numero totale di cellule) rispetto al controllo non trattato. L’analisi iniziale dei dati di diagnostica per immagini ha confermato la relazione tra morfologia degli organoidi e risposta al farmaco. Ciò ha dimostrato la prova di principio che questa tecnica può essere utilizzata negli schermi dei farmaci.
L’uso di organoidi e l’imaging 3D hanno il potenziale di rivoluzione dello screening iniziale nella ricerca farmacologica. Ciò richiede batch standardizzati e ripetibili di un gran numero di organoidi. Poiché gli organoidi vengono coltivati manualmente, questo requisito non può essere soddisfatto facilmente. Cellesce ha affrontato questa esigenza attraverso lo sviluppo di un bioprodotto brevettato. Questa nuova tecnologia, unica nel suo genere, utilizza i processori per la produzione controllata di quantità sufficienti di organoidi per lo screening ad alta rendimento. La divisione Dispositivi Molecolari sta soddisfacendo i requisiti aggiuntivi per l’automazione della gestione dei campioni utilizzando la robotica e l’ottimizzazione dei test utilizzando l’imaging e l’analisi dei dati.
L’uso di organoidi pronti per il test, insieme all’automazione di test di selezione e quantificazione ad alto rendimento, faciliterà una selezione accurata di prodotti terapeutici candidati da grandi biblioteche di composti. Questo farà molta strada verso il processo di identificazione di trattamenti efficaci e di accelerazione della fase di ricerca dei farmaci. L’accurata selezione di potenziali composti terapeutici nelle prime fasi della scoperta di farmaci ridurrà lo spreco di risorse e il costo dello sviluppo. Ciò porterà a un aumento del numero di farmaci sul mercato. I medici saranno quindi in grado di scegliere i trattamenti mirati più adatti per ogni paziente, con effetti indesiderati minimi. Ciò migliorerà la qualità della vita e aumenterà i tassi di sopravvivenza.
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Miglioramento dello sviluppo di farmaci: dispositivi Molecolari e Cellesce puntano a far avanzare l’uso di organoidi
La recente acquisizione di Cellesce conferma l’impegno di Molecular Devices a investire in tecnologie di biologia 3D che trasformano il processo di ricerca di nuovi farmaci e guidano lo sviluppo di nuove soluzioni terapeutiche.
“Molecular Devices ha la capacità, la fama, la portata e le risorse per garantire che la tecnologia Cellesce possa essere ulteriormente sviluppata e utilizzata al suo pieno potenziale”, ha detto Vicky Marsh-Durban, direttore generale di Cellesce. “Siamo entusiasti di portare la nostra esperienza nel settore e la nostra proprietà intellettuale a livello di Dispositivi Molecolari, insieme per massimizzare l’impatto per i clienti nel rivoluzionere la ricerca sui farmaci e sbloccare il pieno potenziale della ricerca sulla biologia 3D rilevante per l’uomo”.
Approfondire la conversazione con Tanya Samazan di Instrument Business Outlook e Susan Murphy, presidente di Molecular Devices, e Vicky Marsh-Durban, direttore generale di Cellesce.
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