Tecnologia a immersione in acqua e imaging ad alto contenuto: uno sguardo più approfondito
I test cellulari tridimensionali (3D) sono emersi come uno strumento importante nella ricerca biologica e nella ricerca sui farmaci, in quanto imitano strettamente gli ambienti in vivo e hanno dimostrato di generare dati più rilevanti dal punto di vista fisiologico rispetto a molti test 2D. Con l’aumento dell’uso di colture 3D per lo screening fenotipico e la valutazione della tossicità, esiste una crescente necessità di ottimizzare la sensibilità, la risoluzione e il rendimento dei saggi.
Qui, esploriamo come gli obiettivi di immersione in acqua ad alte prestazioni sul sistema di imaging ad alto contenuto microconfocale ImageXpress® facilitino queste esigenze in continua crescita, aumentando la sensibilità, la risoluzione e la rendimento di trasmissione per strutture 3D complesse come sferoidi, organoidi e biologia organo su chip.
Cos’è la tecnologia di immersione in acqua?
In termini di imaging ad alto contenuto, la tecnologia a immersione in acqua posiziona automaticamente e coerentemente uno strato d'acqua tra l'obiettivo (ingrandimento) e il campione.
Molti sistemi di imaging cellulare sono progettati per avere aria tra l'obiettivo e il campione. Quando si utilizzano questi obiettivi a secco per l’imaging 3D, una parte significativa della luce fluorescente emessa dal campione viene rifratta fuori dall’obiettivo e si perde. Ciò riduce il segnale proveniente dal campione e provoca la distorsione della sua immagine. Gli obiettivi dell’olio sono stati lo standard di riferimento per l’immagine confocale 3D, perché raccolgono più luce dal campione, il che aumenta l’intensità del segnale e migliora la risoluzione dell’immagine. Tuttavia, gli obiettivi a olio sono comunque problematici, perché l’olio può essere difficile da maneggiare in un sistema automatizzato e questi obiettivi possono causare anch’essi una certa distorsione in caso di imaging di campioni 3D di grandi dimensioni.
Ottenere una maggiore sensibilità e risoluzione senza sacrificare la velocità
rispetto agli obiettivi dell’aria, gli obiettivi di immersione in acqua hanno un’apertura numerica più alta, consentendo loro di raccogliere più luce dal campione. Questo aumenta le intensità dell'immagine fino a quattro volte e riduce al minimo la distorsione, fornendo una rappresentazione più accurata della forma del campione. In parole semplici, nell'acqua esistono delle celle. Posizionando l'acqua tra l'obiettivo e il campione, si è in grado di abbinare meglio l'ambiente cellulare e produrre un'immagine di qualità superiore.
Gli obiettivi di immersione in acqua prendono anche una sezione z molto più fine di un'immagine 3D rispetto agli obiettivi a secco (NA più alto). E grazie alla maggiore raccolta di luce, producono immagini più nitide e più nitide con dettagli cellulare più sottili.
20X Obiettivo immersione in acqua
Disco rotante con foro per perni confocali 42 μm
Proiezione massima di piani 21 z a passi 5 μm (100 μm)
Poiché l'obiettivo di immersione in acqua raccoglie un segnale più elevato dal campione, è possibile ridurre il tempo di esposizione e quindi aumentare la velocità dell'acquisizione. In alternativa, è possibile scegliere di mantenere un tempo di esposizione più elevato e acquisire immagini ancora più luminose.
Ottenere informazioni più dettagliate sui campioni 3D più spessi
Il sistema ImageXpress Micro Confocal include un modulo a disco confocale per tessuti profondi e opzioni di illuminazione laser che possono essere combinate con gli obiettivi di immersione in acqua per aiutare a acquisire immagini ancora più profonde in campioni 3D. Più spesso è il campione, più è probabile che si verifichino interferenze con fori, contaminazioni prodotte dalla luce circostante, che si traducono in foschia e riduzione della qualità dell'immagine. Il modulo del disco confocale del tessuto profondo è progettato per ridurre al minimo la diafisaria tra i fori dei perni e rimuovere l’oscuramento in modo da poter acquisire immagini più in profondità nel campione.
Come funziona l’immersione in acqua sul sistema confocale micro ImageXpress
La tecnologia consiste di due bottiglie, una pompa a membrana e un adattatore per l'obiettivo. La pompa invia pressione nella bottiglia della sorgente e spinge l'acqua verso l'obiettivo. Mentre si verifica l'imaging, l'acqua si rotola dall'obiettivo e viene tirata indietro attraverso il vuoto creato dalla pompa. Il software MetaXpress® ricarica automaticamente l’acqua in pochi millisecondi, se necessario, per un’esperienza senza problemi.
Gli obiettivi di immersione in acqua sono aggiornabili sul campo e possono essere facilmente implementati con modifiche minime a un flusso di lavoro esistente. Quando si accende il sistema per la prima volta o si passa da un oggetto d'aria a un oggetto d'acqua, ci vogliono solo pochi minuti perché l'acqua si sposti sull'obiettivo in modo che l'imaging possa iniziare.
I sensori sono integrati nel sistema di controllo dell'acqua per rilevare i guasti (ad es. perdite) e monitorare la salute del sistema. Il sistema è progettato per fornire e mantenere automaticamente l'acqua all'obiettivo, semplificando la predisposizione e il funzionamento per l'utente. Il software fornisce anche avvisi intuitivi quando è il momento di riempire le bottiglie, che in genere devono essere riempite una volta alla settimana, a seconda dei tipi di campioni che vengono eseguiti.
Non trascurare i tuoi campioni 2D
Quando si prendono in considerazione gli obiettivi di immersione in acqua per l'imaging ad alto contenuto, i campioni 2D non devono essere trascurati. Gli obiettivi di immersione in acqua possono anche essere molto utili per l'imaging 2D, specialmente se è necessario esaminare caratteristiche fini, come i filamenti citoscheletrici. Se si dispone di un test in cui la fluorescenza è molto debole, l'immersione in acqua può essere utilizzata per aumentare il segnale il più possibile.
È inoltre possibile ridurre il tempo di esposizione con i campioni 2D, che consentono di acquisire immagini più velocemente della piastra.
Scoprite di più sul funzionamento degli obiettivi a immersione in acqua con il sistema ImageXpress Micro Confocal e guardate anche la presentazione Innovation Showcase di Tim Baranowski dalla conferenza virtuale ISSCR di quest’anno.