Editing genetico (CRISPR/Cas9) Recenti progressi per migliorare il potenziale clinico
Più di geni 3000 umani sono stati fortemente correlati al tumore e ai disturbi genetici. Il chiarimento delle mutazioni genetiche e delle malattie umane sta diventando sempre più urgente. Forse il metodo di editing del genoma più funzionale è stato influenzato da un meccanismo di risposta immunitaria adattativo, in cui i batteri catturano e scindono il DNA virale per proteggersi dagli attacchi virali. Il meccanismo è stato successivamente adattato da Doudna e Charpentier et al. e denominato il sistema di ripetizione palindromica breve (CRISPR)/sistema associato a CRISPR (Cas) regolarmente interdistanziato per studiare le alterazioni genomiche negli esseri umani. Oggi, l’editing genico di CRISPR/Cas è parte integrante della scoperta farmacologica basata sui geni per scoprire i geni bersaglio ed eseguire knockout, che offre informazioni sul fenotipo risultante. Da questo punto di vista, questa tecnologia rappresenta un’enorme pietra miliare nella correlazione del genoma del paziente con il fenotipo e nella promozione della medicina di precisione.
Come ogni altra modalità genomica, la terapia genica CRISPR/Cas deve essere somministrata in modo efficiente e a misura di paziente. Tuttavia, gli attuali metodi di distribuzione genica hanno dimostrato effetti fuori bersaglio e una mancanza di un knockdown efficiente.
In questo podcast di Drug Targets Review, il Dott. Pietro De Angeli, l’Istituto per la ricerca oftalmica dell’Ospedale universitario di Tübingen, e il Dott. Maarten, il Centro della principessa Maxima, discutono i profili di sicurezza dei metodi di 9 somministrazione di CRISPR/Cas, nonché le attuali tendenze che riguardano la scalabilità e l’uso dei metodi di intelligenza artificiale (IA).
Immergiti nella conversazione in cui discutiamo delle opportunità offerte dalla tecnologia CRISPR/Cas per rivoluzionare la scoperta di farmaci genici.
Profili di sicurezza in primo piano: DNA, mRNA e RNP nella somministrazione di CRISPR/Cas
Affinché l’editing genico di CRISPR/Cas9 funzioni senza problemi, il complesso deve raggiungere il nucleo, dove può localizzare i geni bersaglio.
La somministrazione di CRISPR è mediata dal DNA plasmidico (pDNA), dall’mRNA o dalle ribonucleoproteine (RNP) e le prime due impongono problemi di sicurezza. L’erogazione attraverso il DNA plasmidico o l’mRNA può spesso determinare l’attivazione della risposta immunitaria innata e il pDNA presenta il rischio aggiuntivo di incorporazione nel genoma ospite, con conseguenti effetti avversi a lungo termine. Sebbene le strategie ex vivo possano aiutare a prevedere e mitigare questi rischi, la specificità di CRISPR/Cas9 rimane irrisolta.
Meccanismo del sistema CRISPR/Cas9. L’enzima Cas9 viene inizialmente attivato mediante il legame a un RNA guida e poi mediante il legame alla sequenza genomica corrispondente che precede immediatamente una sequenza PAM trinucleotidica. Quindi, l’enzima Cas9 crea una rottura a doppio filamento, dopodiché viene utilizzato il meccanismo NHEJ o il meccanismo HDR per riparare il DNA, con conseguente modifica della sequenza genica.
Per ridurre il rischio di editing genico, gli scienziati si stanno rivolgendo agli RNP, costituiti dalla proteina Cas9 in complesso con un gRNA mirato. Questo metodo di erogazione offre una maggiore specificità e sicurezza. Ad oggi, Maarten indica la correlazione inversa tra il tempo trascorso dal complesso nell’ospite e la precisione dell’editing genico CRISPR/Cas9: “l’mRNA o per il DNA, necessitano fino a una settimana per la trascrizione e la traduzione di Cas9, mentre un RNP è attivo non appena entra nel nucleo e può svolgere il lavoro in meno di 24 ore. Più a lungo il Cas9 rimane nel nucleo, più è probabile che trovi e accumuli siti off-target. Ecco perché il metodo di editing genico più sicuro sta dando un impulso di Cas9 molto breve attraverso l’RNP”. Un altro vantaggio degli RNP è la facilità di ottimizzazione, aggiunge Pietro. “Quando si utilizzano gli RNP, è più facile regolare la concentrazione dei reagenti, il che influisce sull’efficienza target. Mentre nella somministrazione di CRISPR basato sul DNA, l’efficienza di trasfezione e il numero di copie di DNA sono difficili da prevedere e mettere a punto”.
Un’altra sfida posta dal CRISPR/Cas9 basato su DNA o mRNA è che potrebbe alterare il profilo trascrittomico e proteomico dell’ospite. Questo cambiamento si verifica principalmente perché l’ospite riorganizza le sue risorse energetiche per la trascrizione e la traduzione delle forme di DNA e mRNA. Il carico metabolico risultante può perturbare il metabolismo dell’ospite, alterando il trascrittoma e il proteasoma. Al contrario, l’erogazione di CRISPR/Cas9 come RNP è un complesso pronto a funzionare ed esercitare l’editing genico desiderato, quindi non causa uno spostamento nel genoma verso l’espressione di Cas9.
Applicazioni ex vivo: Esplorare la scalabilità e la fattibilità di CRISPR
Il sistema CRISPR/Cas9 non può essere erogato al nucleo come complesso nudo, quindi il veicolo di erogazione CRISPR appropriato svolge un ruolo significativo nella protezione dell’integrità del complesso. Per affrontare gli sforzi attuali, gli scienziati condividono il lavoro pionieristico dei laboratori di ricerca.
Il Prof. David Liu, vice-presidente della Facoltà presso il Broad Institute of MIT e Harvard, ha ingegnerizzato nanoparticelle lipidiche (LNP) di origine virale in grado di incapsulare il complesso. Gli LNP hanno dimostrato un’erogazione efficiente in tutte le forme di CRISPR/Cas9, compreso l’RNP preformato. Questo macchinario ha guidato l’erogazione del complesso a specifici organi di interesse (Banskota et al., 2022, Cell 185, 250–265). Nel frattempo, il laboratorio di Jennifer Doudna ha migliorato la specificità del sito di Cas9 aggiungendo segnali di localizzazione nucleica al terminale C e N della proteina. Gli esperimenti in vivo hanno confermato un editing genico preciso nel cervello dei topi (Stahl EC, et al., Mol Ther. 2023 2;31(8):2422-2438) agosto.
Sebbene i metodi di somministrazione continuino a migliorare, il potenziale clinico dell’editing genetico di CRISPR/Cas9 non è stato completamente realizzato, principalmente perché l’erogazione virale, associata a un editing off-target prolungato, è ancora lo standard di riferimento. Tra i metodi di erogazione non virali, l’elettroporazione si distingue per le sue capacità di erogazione sicure e robuste compatibili con gli RNP. Questo metodo crea pori nella membrana cellulare, consentendo l’ingresso continuo di RNP nel citoplasma e impedendone l’endocitosi o la fuoriuscita endosomiale.
Un'altra serie di problemi emerge quando si tratta di scalabilità. Sebbene l’endonucleasi Cas9 possa essere prodotta in grandi lotti senza costi elevati, l’RNA guida (gRNA) è specifico non solo per la malattia o l’approccio terapeutico, ma anche per gli individui. Pietro ritiene che il percorso verso l’aumento del gRNA sia pavimentato da rischi. “Al momento, quello che vedo come un problema non è la tecnologia stessa, ma piuttosto il quadro giuridico. Le grandi aziende farmaceutiche si stanno concentrando sui disturbi più comuni perché sono alla ricerca di opportunità commercialmente valide. Un paziente appartenente a questo gruppo ha una maggiore probabilità di accedere ai trattamenti di editing genico. Per il trattamento delle malattie rare, gli istituti di ricerca accademici e non profit devono impegnarsi per facilitare l’accesso dei pazienti”. Secondo Maarten, la procedura normativa per le malattie rare deve essere diversa: “Per ogni malattia, la sicurezza del complesso deve essere dimostrata attraverso dati ex vivo sostanziali. Per le malattie rare con un numero limitato di pazienti in tutto il mondo, non è possibile generare questo rapporto completo. Attualmente, le iniziative sponsorizzate da Jennifer Doudna e altri esperti CRISPR stanno collaborando con la FDA per ammorbidire i requisiti preclinici dei dati e la presentazione di documenti IND per malattie rare”. Questa proposta prevede l’uso dell’editing genico ex-vivo per generare cellule modificate che possono essere somministrate ai pazienti, in modo che l’editing genomico sia considerato un reagente piuttosto che un farmaco.
Migliorare la medicina di precisione CRISPR: La sinergia di CRISPR/Cas con IA e ML
Gli strumenti di apprendimento automatico (ML) e IA, simili al loro impatto in molti altri settori, sono considerati rivoluzionari nell’editing genico e nella scoperta farmacologica basata sui geni. Nel caso di CRISPR/-Cas9, possono essere utilizzati per assemblare set di dati di grandi dimensioni di editing specifico del sito e fuori target e correlarli a diversi editor di base o strutture RNP 3D. Gli algoritmi di apprendimento automatico possono fornire la sequenza di gRNA necessaria per bersagliare un gene specifico, nonché tutte le modifiche a livello di proteina necessarie per raggiungere il livello di specificità. Pertanto, gli scienziati possono ora progettare il gRNA più sicuro ed efficiente.
Sono stati utilizzati anche strumenti di IA per prevedere l’efficacia di varianti più evolute di CRISPR/Cas9. Per migliorare il prime editing, i ricercatori hanno sviluppato nCas9 - nickasi Cas9 fusa per invertire la trascrittasi - per semplificare vari tipi di editing genomico, come mutazioni puntiformi, inserzioni e delezioni. Sebbene questo nuovo sistema produca una migliore efficienza di prime editing in teoria, il suo design e la sua sicurezza devono essere valutati accuratamente, il che è il punto in cui entra in gioco la potenza predittiva degli strumenti di IA. Maarten sottolinea il valore dell’IA nella scoperta farmacologica basata sui geni: "Ci aiuta a scansionare centinaia di combinazioni Cas9 - gRNA per rilevare quelle 10 migliori".
Il futuro di CRISPR: Trasformare gli approcci terapeutici
Il sequenziamento convenzionale del genoma non è sufficiente per chiarire il contesto genetico delle malattie. Sebbene i ricercatori possano isolare le cellule da un paziente e confrontare il genoma con quelle sane, questo confronto non copre necessariamente le migliaia di mutazioni puntiformi che contribuiscono al fenotipo della malattia. L’editing del genoma CRISPR/Cas9 aiuta a superare queste barriere e trae grande beneficio da un preciso modello di malattia e da una medicina personalizzata per mirare a mutazioni specifiche. Per Pietro, il trattamento è solo un lato della moneta: “Possiamo usarlo non solo come strumento di trattamento, ma anche come mezzo per la ricerca sulle malattie. I modelli cellulari 3D, come gli organoidi derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), sono incredibilmente preziosi per emulare la biologia umana complessa. Quindi, introducendo una mutazione associata alla malattia nel genoma iPSC, possiamo generare colture cellulari che possono differenziarsi nel fenotipo della malattia”. Questo aspetto di CRISPR/Cas9 vale la pena prestare attenzione perché il background genetico di una malattia è fondamentale per sviluppare potenti strumenti terapeutici.
Naturalmente, il ruolo della modellazione cellulare 3D non può essere sovrastimato. Attraverso le tecnologie di coltura cellulare 3D e CRISPR/Cas9, i ricercatori possono generare modelli cellulari isogenici, che racchiudono l’intero panorama genomico con cellule estratte da pochi pazienti.
Conclusione - Prossimi passi nella ricerca e nell’applicazione CRISPR
Le opportunità terapeutiche sbloccate da CRISPR/Cas9 sono ampie, specialmente nella modifica di mutazioni puntiformi e nella riparazione genica ex vivo e - in futuro - in vivo. Ciò può aumentare l’accesso al trattamento per i pazienti con malattie rare che presentavano mutazioni precedentemente difficili da raggiungere.
È importante notare che CRISPR non è una soluzione unica. Soprattutto quando si parla di cancro, non invalida il valore degli approcci chemioterapici. Al contrario, può creare un effetto sinergico immergendosi nelle radici genomiche della malattia, mentre il composto farmacologico inibisce i meccanismi associati alla malattia a livello chemioenzimatico. La combinazione di CRISPR con farmaci approvati dalla FDA può accelerarne l’ingresso nelle applicazioni di trattamento del tumore clinico tradizionali.
Nel podcast abbiamo esplorato metodi innovativi di somministrazione di CRISPR, tra cui RNP, particelle virali ingegnerizzate e formulazioni di nanoparticelle, evidenziando il loro potenziale di promuovere le applicazioni di CRISPR-Cas9 più vicine all’uso clinico. L’enfasi è stata posta sulla necessità di tecniche di editing genico precise ed efficienti. Per supportare questi progressi scientifici, i sistemi di imaging ad alto contenuto ImageXpress di Molecular Devices offrono informazioni critiche consentendo un’osservazione dettagliata di questi meccanismi di somministrazione all’interno delle cellule. Inoltre, l’integrazione di strumenti come i lettori per micropiastre SpectraMax e il sistema FLIPR Penta migliora la nostra comprensione della crescita, della manutenzione e della funzionalità cellulare, specialmente quando si lavora con modelli complessi come gli organoidi. Durante la discussione sull’importanza di semplificare il processo di ricerca, la conversazione ha anche riguardato il ruolo dell’automazione nei laboratori moderni. Soluzioni come il sistema automatizzato di coltura cellulare CellXpress.ai supportano l’automazione del processo di coltura cellulare, contribuendo a risultati più affidabili e riproducibili nella ricerca scientifica. Sono disponibili soluzioni automatizzate che ottimizzano l’archiviazione IND durante lo screening clonale, come il ClonePix 2 Colony Picker con garanzia di monoclonalità. Le soluzioni di automazione di laboratorio personalizzate sono state menzionate come un modo per collaborare con gli scienziati, adattando i flussi di lavoro per soddisfare le esigenze specifiche dei loro studi CRISPR-Cas9, allineando così le capacità tecnologiche con la ricerca di scoperte scientifiche rivoluzionarie.