Editing genetico (CRISPR/Cas9)

Accelerazione dello sviluppo di linee cellulari sottoposte a editing genetico

Scoprite in che modo il nuovissimo imager CloneSelect® FL può facilitare la rilevazione delle cellule trasfettate con successo, permettendo di ridurre i tempi di sviluppo delle linee cellulari e di aumentare rapidamente la scala delle vostre attività di ricerca. Questo sistema permette di escludere in una fase precoce i pool di cellule con bassa efficienza di trasfezione, confermare e monitorare varie modifiche eseguite con la tecnologia CRISPR grazie alla rilevazione in fluorescenza multicanale ed eseguire lo screening delle cellule con accuratezza e affidabilità, riducendo allo stesso tempo il rischio di disturbi dovuti a un eccessivo numero di passaggi in coltura grazie al nuovo design della robotica.

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Screening della produttività dei cloni e titolo

Un fattore importante per l’identificazione dei cloni di valore elevato è la determinazione della produttività delle colonie derivate da singole cellule. Lo screening della produttività tramite l’uso di approcci tradizionali è laborioso e richiede tempo e consiste generalmente in un processo multifase che prevede l’isolamento di singole cellule mediante la tecnica della diluizione limite, seguito dalla valutazione del titolo tramite saggi ELISA. Il sistema ClonePix 2 combina la selezione del fenotipo, l’isolamento di singole cellule e lo screening della produttività in un unico passaggio, permettendo di ridurre drasticamente i tempi di screening e aumentare il numero di candidati.

• Rapido screening e selezione di cloni stabili altamente produttivi
• Ottimizzazione automatizzata della produzione di IgG in cellule CHO
• Miglioramento dello sviluppo di ibridomi virus-specifici

Garanzia di clonalità affidabile mediante l’uso di calceina AM

Garanzia di clonalità affidabile mediante l’uso di calceina AM con effetti minimi sulla vitalità

Qui è presentato un flusso di lavoro ottimizzato basato sull’uso del reagente fluorescente calceina AM in combinazione con un modello dell’imager CloneSelect™ provvisto di funzionalità per la fluorescenza, che mostra una vitalità simile a quella ottenuta in condizioni senza marcatura, fornendo allo stesso tempo elevate garanzie di clonalità.

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Esperimenti di editing genomico con la tecnologia CRISPR/Cas9

Il sistema di editing genetico CRISPR/Cas9 è uno strumento molto diffuso per lo studio della funzione dei geni in virtù della sua relativa facilità d’uso e della sua accuratezza. Inoltre, il sistema ha grandi potenzialità per il trattamento delle malattie ereditarie. La validazione dell’editing genetico eseguito con la tecnologia CRISPR/Cas9 è una procedura necessaria per garantire che il knockdown o il knockout dei geni di interesse sia avvenuto correttamente. Qui illustriamo come può essere utilizzata la famiglia di strumenti Molecular Devices negli esperimenti di editing genetico con la tecnologia CRISPR/Cas9 per il knockdown della proteina ATG5 (Autophagy-Related Protein 5) in cellule HEK293.

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Monoclonalità

Lo sviluppo di linee cellulari e la verifica della monoclonalità sono fasi cruciali nel processo di generazione di molecole biofarmaceutiche, come gli anticorpi monoclonali. In seguito all’isolamento di una singola cellula vitale che esprime in maniera robusta la proteina di interesse, può essere sviluppata una linea cellulare. Un requisito fondamentale in questo processo è la documentazione delle evidenze di clonalità. Generalmente, la documentazione della clonalità è basata su immagini e prevede l’acquisizione di un’immagine di una singola cellula da includere nella presentazione di richieste alle autorità regolatorie.

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Separazione di singole cellule

Lo sviluppo di linee cellulari richiede la scoperta di cloni derivati da singole cellule che producano livelli elevati e costanti della proteina terapeutica target. La prima fase del processo è costituita dall’isolamento di singole cellule vitali. Il metodo della diluizione limite è una tecnica basata sulla probabilità statistica, ma richiede molto tempo. Il CloneSelect Single-Cell Printer permette l’isolamento delicato delle cellule in modo da massimizzare la vitalità cellulare, fornendo inoltre evidenze dirette della clonalità attraverso una serie di cinque immagini acquisite durante la dispensazione delle cellule.

• Un flusso di lavoro basato sulla tecnologia microfluidica per la dispensazione di singole cellule e l’imaging delle micropiastre, ottimizzato per offrire efficienza, vitalità e un rapporto sulla monoclonalità
• Un flusso di lavoro che combina l’isolamento di singole cellule e l’imaging delle micropiastre migliora l’efficienza di clonaggio offrendo maggiori garanzie di clonalità
• Scheda tecnica: CloneSelect Single-Cell Printer

Efficienza di trasfezione

L’efficienza di trasfezione di un gene reporter fluorescente può essere monitorata in vari modi. Uno di essi consiste nel misurare la fluorescenza con un lettore per micropiastre. Questo metodo permette di valutare il livello complessivo di fluorescenza in ciascun pozzetto del test, ma non fornisce la percentuale di cellule trasfettate. Un metodo più informativo per valutare l’efficienza di trasfezione consiste nell’analizzare le cellule utilizzando un citometro per imaging, che consente di determinare il numero di cellule che esprimono un livello di fluorescenza rilevabile rispetto al numero di cellule totali. Il citometro per imaging offre l’ulteriore vantaggio di permettere il calcolo della confluenza cellulare prima della trasfezione, un’informazione che può essere utilizzata nell’ambito dello sviluppo del saggio.

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Validazione di cellule sottoposte a editing con il sistema CRISPR mediante western blot

La tecnologia di editing genetico CRISPR richiede un attento monitoraggio dell’intero processo per garantire risultati accurati. Il lettore per micropiastre multimodale SpectraMax i3x offre una soluzione completa per l’analisi dei risultati di un esperimento di editing eseguito con il sistema CRISPR, dalla trasfezione iniziale alla conferma del knockdown della proteina. Con il citometro MiniMax, i ricercatori possono valutare l’efficienza di trasfezione confrontando il numero totale di cellule non marcate con il numero di cellule trasfettate che esprimono fluorescenza. Il sistema di rilevazione di western blot ScanLater consente la rilevazione sensibile e l’analisi quantitativa delle proteine di interesse nelle cellule di controllo e nelle cellule sottoposte a editing con la tecnologia CRISPR.

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