Western blot
Cos’è il western blot?
Il western blot è una tecnica diffusa utilizzata per la rilevazione e la quantificazione delle proteine. Consente la separazione e l’identificazione di una specifica proteina di interesse in una complessa miscela di proteine, ad esempio un lisato cellulare. Con applicazioni in diagnostica, biotecnologia, biologia molecolare, proteomica e molto altro, i western blot sono ampiamente utilizzati per valutare i livelli di espressione proteica nelle cellule, nonché i cambiamenti nelle dimensioni e altre proprietà.
Metodiche di western blot
Esistono numerose metodiche di western blot da considerare: a seconda dell’anticorpo secondario utilizzato, la rilevazione della proteina bersaglio può essere basata sulla colorimetria, sulla chemiluminescenza o sulla fluorescenza. Queste metodiche sono descritte di seguito e richiedono apparecchiature diverse per la rilevazione. Ad esempio, la chemiluminescenza può essere rilevata utilizzando una pellicola radiografica o un’apparecchiatura di imaging digitale, mentre un anticorpo secondario fluorescente richiede un imager a fluorescenza. Ciascun tipo di rilevazione presenta vantaggi e svantaggi che vanno presi in considerazione nella scelta della metodica.
Un’altra metodica introdotta da noi, il sistema di rilevazione di western blot ScanLater™, è la prima del suo genere a permettere la rilevazione di western blot in una piattaforma con lettore per micropiastre multimodale. Utilizzando questo saggio che non prevede l’uso di substrato, i ricercatori possono ottenere una sensibilità equivalente a quella dei saggi in chemiluminescenza tradizionali ed eseguire applicazioni di western blot, ELISA e di altro tipo su un unico lettore. Le nostre note applicative in primo piano qui di seguito forniscono ulteriori dettagli.
Flusso di lavoro per un saggio di western blot
Di seguito è descritta la procedura utilizzata per un tipico saggio di western blot:
1. Esecuzione dell’elettroforesi: per prima cosa, le proteine vengono separate in base alle loro dimensioni mediante elettroforesi su gel.
2. Trasferimento: le proteine vengono quindi trasferite su una membrana di blotting, generalmente in nitrocellulosa o PVDF, che viene saggiata con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse.
3. Bloccaggio con tampone di bloccaggio: questo passaggio serve per impedire il legame dell’anticorpo primario (passaggio successivo) alla membrana stessa.
4. Incubazione con l’anticorpo primario: l’anticorpo primario si lega alla proteina di interesse.
5. Lavaggio con tampone di lavaggio: l’anticorpo primario non legato viene lavato via.
6. Incubazione con l’anticorpo secondario: viene aggiunto un anticorpo secondario che riconosce e lega l’anticorpo primario. Questo anticorpo secondario è coniugato con un enzima o altro materiale che consente di rilevare la proteina di interesse, che appare come una banda sul blot.
7. Lavaggio con tampone di lavaggio: l’anticorpo secondario non legato viene lavato via.
8. Rilevazione mediante la metodica/reazione chimica prescelta: la proteina target può essere rilevata mediante metodiche colorimetriche, in fluorescenza o in luminescenza a seconda dell’anticorpo secondario utilizzato.
Panoramica del western blot
Metodiche di western blot
Applicazioni del western blot
- Rilevazione e quantificazione di proteine con il sistema di rilevazione di western blot ScanLater
- Validazione di cellule sottoposte a editing con il sistema CRISPR utilizzando tecniche di imaging e rilevazione di western blot
- Dai pozzetti ai western: studio della risposta cellulare allo shock termico
- Stima del peso molecolare di proteine mediante l’uso del marcatore di peso molecolare delle proteine per western blot ScanLater
- Rilevazione di proteine marcate con europio