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Western blot

Cos’è il western blot?

Il western blot è una tecnica diffusa utilizzata per la rilevazione e la quantificazione delle proteine. Consente la separazione e l’identificazione di una specifica proteina di interesse in una complessa miscela di proteine, ad esempio un lisato cellulare. Con applicazioni in diagnostica, biotecnologia, biologia molecolare, proteomica e molto altro, i western blot sono ampiamente utilizzati per valutare i livelli di espressione proteica nelle cellule, nonché i cambiamenti nelle dimensioni e altre proprietà.

 

Metodiche di western blot

Esistono numerose metodiche di western blot da considerare: a seconda dell’anticorpo secondario utilizzato, la rilevazione della proteina bersaglio può essere basata sulla colorimetria, sulla chemiluminescenza o sulla fluorescenza. Queste metodiche sono descritte di seguito e richiedono apparecchiature diverse per la rilevazione. Ad esempio, la chemiluminescenza può essere rilevata utilizzando una pellicola radiografica o un’apparecchiatura di imaging digitale, mentre un anticorpo secondario fluorescente richiede un imager a fluorescenza. Ciascun tipo di rilevazione presenta vantaggi e svantaggi che vanno presi in considerazione nella scelta della metodica.

Un’altra metodica introdotta da noi, il sistema di rilevazione di western blot ScanLater™, è la prima del suo genere a permettere la rilevazione di western blot in una piattaforma con lettore per micropiastre multimodale. Utilizzando questo saggio che non prevede l’uso di substrato, i ricercatori possono ottenere una sensibilità equivalente a quella dei saggi in chemiluminescenza tradizionali ed eseguire applicazioni di western blot, ELISA e di altro tipo su un unico lettore. Le nostre note applicative in primo piano qui di seguito forniscono ulteriori dettagli.

Cartuccia di rilevazione di western blot ScanLater

Il sistema di rilevazione di western blot ScanLater™ permette la rilevazione di western blot su un lettore per micropiastre

 

Flusso di lavoro per un saggio di western blot

Di seguito è descritta la procedura utilizzata per un tipico saggio di western blot:

Flusso di lavoro per un saggio di western blot

 

1. Esecuzione dell’elettroforesi: per prima cosa, le proteine vengono separate in base alle loro dimensioni mediante elettroforesi su gel.

2. Trasferimento: le proteine vengono quindi trasferite su una membrana di blotting, generalmente in nitrocellulosa o PVDF, che viene saggiata con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse.

3. Bloccaggio con tampone di bloccaggio: questo passaggio serve per impedire il legame dell’anticorpo primario (passaggio successivo) alla membrana stessa.

4. Incubazione con l’anticorpo primario: l’anticorpo primario si lega alla proteina di interesse.

5. Lavaggio con tampone di lavaggio: l’anticorpo primario non legato viene lavato via.

6. Incubazione con l’anticorpo secondario: viene aggiunto un anticorpo secondario che riconosce l’anticorpo primario e si lega ad esso. Questo anticorpo secondario è coniugato con un enzima o con altro materiale che consente la rilevazione della proteina di interesse, che apparirà come una banda sul blot.

7. Lavaggio con tampone di lavaggio: l’anticorpo secondario non legato viene lavato via.

8. Rilevazione mediante la metodica/reazione chimica prescelta: la proteina bersaglio può essere rilevata mediante metodiche colorimetriche, in fluorescenza o in luminescenza a seconda dell’anticorpo secondario utilizzato.

 

 

  • Western blot colorimetrico

    Western blot colorimetrico

    Una metodica di western blot colorimetrica utilizza un anticorpo secondario coniugato con un enzima e un substrato cromogeno per la rilevazione.

    Vantaggi:

    • Non sono richieste apparecchiature speciali

    Svantaggi:

    • Sensibilità limitata (nell’ordine dei pg)
    • I blot non possono essere sottoposti a stripping e risaggiati per studiare ulteriori target

    Western blot in chemiluminescenza

    Western blot in chemiluminescenza

    In un western blot in chemiluminescenza vengono utilizzati un anticorpo secondario coniugato con un enzima e un substrato luminescente. I risultati vengono rilevati mediante una pellicola radiografica e attrezzatura per camera oscura oppure mediante un sistema di imaging digitale.

    Vantaggi:

    • Sensibilità (livelli di fg)
    • I blot possono essere sottoposti a stripping e risaggiati

    Svantaggi:

    • I risultati possono essere non lineari
    • Il segnale è di breve durata
    • Le apparecchiature necessarie per la rilevazione possono essere costose e ingombranti

  • Western blot in fluorescenza

    Western blot in fluorescenza

    In un western blot in fluorescenza viene utilizzato un anticorpo secondario coniugato con un fluoroforo, per cui non è necessario alcun substrato. Per la rilevazione dei risultati è necessario un imager a fluorescenza.

    Vantaggi:

    • Intervallo dinamico più ampio e maggiore linearità rispetto alle metodiche colorimetriche o in luminescenza
    • È possibile eseguire saggi multiplex utilizzando fluorofori diversi

    Svantaggi:

    • Può essere meno sensibile rispetto alla chemiluminescenza
    • Richiede un sistema di imaging a fluorescenza dedicato

    Sistema di rilevazione di western blot ScanLater

    Sistema di rilevazione di western blot ScanLater

    Nel sistema di rilevazione di western blot ScanLater, l’anticorpo secondario è coniugato con un fluoroforo a tempo risolto, per cui questa tecnica combina i vantaggi delle metodiche in fluorescenza e in chemiluminescenza.

    • Non è necessario alcun substrato per la rilevazione
    • Stabilità del segnale di mesi o più
    • Sensibilità a livelli inferiori ai picogrammi
    • Ampio intervallo dinamico

    Scarica la scheda tecnica  

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  • Rilevazione e quantificazione di proteine con il sistema di rilevazione di western blot ScanLater

    Rilevazione di western blot ScanLater per la rilevazione di proteine

    La rilevazione delle proteine è un processo importante nell’attuale ricerca clinica e farmaceutica e i western blot sono tra i metodi utilizzati più comunemente a tale scopo. Vengono utilizzate varie tecniche per rilevare le proteine sulle membrane dei western blot, comprese la fluorescenza e la chemiluminescenza. Tuttavia, ogni tecnica presenta le sue limitazioni ed esiste una costante necessità di migliorare la quantificazione, l’accuratezza e l’intervallo dinamico.

    Questa nota applicativa dimostra l’ampio intervallo dinamico dovuto al background ridotto e la stabilità di rilevazione nel tempo che consente di effettuare varie letture. Inoltre, un confronto del sistema per western blot Scanlater con una metodica in chemiluminescenza evidenzia il miglioramento della sensibilità.

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    Validazione di cellule sottoposte a editing con il sistema CRISPR utilizzando tecniche di imaging e rilevazione di western blot

    Validazione di cellule sottoposte a editing con il sistema CRISPR utilizzando tecniche di imaging e rilevazione di western blot

    L’editing genomico è stato ampiamente utilizzato per studiare l’espressione genica e la funzione delle proteine, ma molti di questi metodi sono laboriosi e inaccurati1. Il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 è diventato uno strumento molto diffuso per l’editing dei geni in virtù della sua elevata accuratezza e facilità d’uso2.

    Qui illustriamo come utilizzare il lettore per micropiastre multimodale SpectraMax i3x e il sistema di rilevazione di western blot ScanLater per la validazione dell’editing genomico eseguito con il metodo CRISPR/Cas9.

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  • Dai pozzetti ai western: studio della risposta cellulare allo shock termico

    Dai pozzetti ai western: Risposta cellulare allo shock termico

    Lo studio di una risposta cellulare può comportare svariati approcci per ottenere le informazioni: imaging, saggi di proliferazione e vitalità basati su cellule, western blot per esaminare le variazioni nell’espressione proteica e altro ancora. Spesso occorrono varie piattaforme di strumenti per raccogliere i risultati richiesti e può quindi essere necessario imparare a utilizzare vari pacchetti software.

    In questa nota applicativa mostriamo in che modo sono stati raccolti i dati relativi a vari parametri cellulari correlati utilizzando un singolo strumento, la piattaforma di rilevazione multimodale SpectraMax® i3.

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    Stima del peso molecolare di proteine mediante l’uso del marcatore di peso molecolare delle proteine per western blot ScanLater

    Stima del peso molecolare delle proteine

    Il marcatore di peso molecolare delle proteine per western blot ScanLater™ è un componente essenziale del sistema di rilevazione di western blot ScanLater™. Le principali applicazioni di questo marcatore di peso molecolare delle proteine includono la stima del peso molecolare delle proteine, la visualizzazione di elettroforesi su gel e la valutazione del processo di trasferimento dal gel al blot.

    Scoprite in che modo gli utenti possono seguire il flusso di lavoro di elettroforesi e di blotting ottimizzato per la loro applicazione.

    Leggi la nota applicativa  

  • Rilevazione di proteine marcate con europio

    Rilevazione di proteine marcate con europio

    Rilevazione e quantificazione di proteine mediante western blot basata su proteine marcate con europio mediante l’uso di un lettore per piastre

    Qui è descritto un nuovo sistema per l’analisi di western blot incorporato nel lettore per micropiastre multimodale SpectraMax®. Le membrane vengono saggiate con streptavidina o anticorpi secondari marcati con europio che si legano alla proteina di interesse. L’europio (Eu) emette fluorescenza di lunga durata, nell’ordine di 1 msec, e la rilevazione viene eseguita con una modalità basata sulla fluorescenza a tempo risolto (Time-Resolved Fluorescence, TRF), che riduce in maniera significativa il background dovuto all’autofluorescenza o ad altre fonti di emissioni di breve durata.

Ultime risorse

Risorse per il western blot

Video e webinar

Cartuccia di rilevazione di western blot ScanLater

Il sistema di rilevazione di western blot ScanLater™ permette la rilevazione di western blot su un lettore per micropiastre