Generazione di linee cellulari stabili per la produzione di vaccini
Ottimizzazione del flusso di lavoro per la generazione di linee cellulari stabili
Lo sviluppo di linee cellulari consiste nel processo di generazione di una popolazione di cellule di derivazione clonale che è stata ingegnerizzata geneticamente per esprimere un fenotipo desiderato (come la produzione di grandi quantità di una proteina ricombinante) per un periodo di tempo prolungato. Le singole cellule proliferano per formare colonie che possono poi essere valutate per la presenza delle caratteristiche desiderate.
In questo video, Justin Dranschak, responsabile delle piattaforme per il settore biofarmaceutico, presenta il nostro flusso di lavoro per lo sviluppo di una linea cellulare stabile e indica i sistemi che possono aiutarvi nelle vostre attività di ricerca.
Passaggio 1: Trasfezione stabile
Il processo di sviluppo di una linea cellulare ha inizio con l’introduzione di DNA estraneo (codificante per la proteina ricombinante di interesse) in una cellula ospite, un processo noto come trasfezione. Dopo la trasfezione, le cellule iniziano a esprimere la proteina per un periodo temporaneo (generalmente meno di una settimana), prima di interromperne completamente la produzione. Tuttavia, una piccola sottopopolazione mantiene la capacità di esprimere la proteina ricombinante per periodi più lunghi a causa dell’integrazione del DNA estraneo nel proprio genoma. Queste cellule trasfettate stabilmente vengono selezionate per la fase successiva.
Passaggio 2: Arricchimento del pool
Il DNA estraneo codificante per la proteina di interesse include spesso un marcatore selezionabile aggiuntivo che può essere utilizzato per separare le cellule trasfettate stabilmente da quelle non trasfettate. Ad esempio, spesso viene aggiunta al DNA estraneo la proteina fluorescente verde (Green Fluorescent Protein, GFP) in modo che le cellule trasfettate diventino fluorescenti e possano essere differenziate da quelle non trasfettate che non presentano fluorescenza. Esiste una stretta correlazione tra i livelli di espressione della proteina ricombinante e quelli del marcatore GFP incluso nel DNA estraneo, il che permette ai ricercatori di utilizzare l’intensità di fluorescenza della GFP per identificare e arricchire i pool di cellule selezionando quelle con un’elevata espressione della proteina.
Passaggio 3: Isolamento di singole cellule
Il processo di trasfezione stabile, sia esso mirato o casuale, genera una popolazione cellulare che presenta un’espressione eterogenea della proteina. Pertanto, è necessario isolare e clonare singole cellule per assicurarsi che la popolazione cellulare sia geneticamente identica e ridurre significativamente l’eterogeneità dell’espressione. L’isolamento di singole cellule è il processo di separazione di singole cellule vive da un blocco solido di tessuto o da una sospensione cellulare per ulteriore analisi.
Passaggio 4: Verifica della monoclonalità e crescita cellulare
Il clonaggio di singole cellule è una fase cruciale del processo di sviluppo di una linea cellulare. È importante verificare che le singole cellule siano correttamente isolate l’una dall’altra in una micropiastra, un processo che viene spesso documentato mediante un imager di cellule. Generalmente, le cellule vengono monitorate per controllarne la crescita dopo la fase di clonaggio per assicurarsi che le loro proprietà di crescita non siano cambiate radicalmente. Questa verifica include l’osservazione del processo di formazione di una colonia di cellule a partire da una singola cellula.
Passaggio 5: Titolo e screening CQA
Si tratta di un test che permette di rilevare la quantità di anticorpi o proteine ricombinanti prodotti dalla linea cellulare di derivazione clonale.
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