Cos’è il voltage-clamp a singolo elettrodo discontinuo (dSEVC)?
Nel voltage-clamp a singolo elettrodo discontinuo (discontinuous Single-Electrode Voltage Clamp, dSEVC), le operazioni di registrazione del voltaggio e di passaggio della corrente vengono eseguite attraverso la stessa micropipetta. Vengono utilizzate tecniche di ripartizione temporale per evitare interazioni tra le due operazioni (Fig. 1).
Figura 1. Schema del circuito del sistema di voltage-clamp a singolo elettrodo discontinuo.
Una singola micropipetta (ME1) penetra nella cellula e il voltaggio registrato (Vp) viene livellato da un headstage a guadagno unitario (A1). Supponiamo che Vpsia esattamente uguale al potenziale di membrana istantaneo (Vm). Un circuito di campionamento e tenuta (SH1) campiona Vme mantiene costante il valore registrato (Vms) per il resto del ciclo.
Vmsviene confrontato con un voltaggio di comando (Vcmd) in un amplificatore differenziale (A2). L’uscita di questo amplificatore diventa l’ingresso di una sorgente di corrente controllata (Controlled-Current Source, CCS) se l’interruttore S1 è nella posizione di passaggio di corrente. La CCS inietta nella micropipetta una corrente che è direttamente proporzionale al voltaggio all’ingresso della CCS, indipendentemente dalla resistenza della micropipetta. Il guadagno di questo circuito a transconduttanza è GƮ.
Il periodo di iniezione di corrente è illustrato all’inizio della forma d’onda temporale.
Figura 2. Onde temporali del voltage-clamp a singolo elettrodo discontinuo.
S1 è mostrato nella posizione di passaggio di corrente, durante il quale viene iniettato un impulso quadrato di corrente nella micropipetta, che provoca un aumento in Vp. La velocità dell’aumento è limitata dagli effetti parassiti della capacità attraverso la parete delle micropipetta in vetro verso la soluzione e della capacità all’ingresso dell’amplificatore separatore. Il valore finale di Vpè costituito principalmente dal calo di voltaggio IR attraverso la micropipetta dovuto al passaggio della corrente Ioattraverso la resistenza della micropipetta Rp. Soltanto una piccola frazione di Vpè costituita dal potenziale di membrana (Vm) registrato sulla punta.
S1 viene poi commutato sulla posizione di registrazione del voltaggio. Quando l’ingresso della CCS è pari a 0 volt, la corrente di uscita corrispondente è pari a zero e Vpdiminuisce passivamente. Durante il periodo di registrazione del voltaggio, Vpcala asintoticamente verso Vm. È necessario lasciar trascorrere un tempo sufficiente affinché Vpraggiunga un valore compreso in un intervallo di un millivolt o meno da Vm. Ciò richiede un periodo pari a fino a nove costanti di tempo della micropipetta (ʈp). Alla fine del periodo di registrazione del voltaggio, viene preso un nuovo campione di Vm e ha inizio un nuovo ciclo. Il voltaggio effettivo utilizzato ai fini della registrazione è Vms.
Come illustrato nella forma d’onda temporale inferiore, Vmssi sposta di piccoli incrementi intorno al valore medio. La differenza tra Vms(avg)e Vcmd corrisponde all’errore di stato stazionario (Ɛ) del blocco che si verifica perché il guadagno (GƮ) della CCS è limitato. L’errore diventa progressivamente più piccolo all’aumentare di GƮ.
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