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Elettrofisiologia patch-clamp

La casa della famosa guida Axon:

Una guida alle tecniche di laboratorio di biofisica ed elettrofisiologia

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Elettrofisiologia patch-clamp

La tecnica di patch-clamp è un versatile strumento elettrofisiologico per comprendere il comportamento dei canali ionici. I canali ionici sono presenti in tutte le cellule, ma quelle che vengono studiate più frequentemente mediante tecniche di patch-clamp sono i neuroni, le fibre muscolari, i cardiomiociti e gli ovociti con iperespressione di singoli canali ionici.

Per valutare la conduttanza di singoli canali ionici, un microelettrodo forma un sigillo ad alta resistenza con la membrana cellulare e viene rimosso un frammento di membrana cellulare contenente il canale ionico di interesse. In alternativa, mentre il microelettrodo forma il sigillo con la membrana cellulare, questo piccolo frammento può essere perforato per fornire all’elettrodo un accesso elettrico all’intera cellula. Viene poi applicata tensione, con formazione di un blocco del voltaggio (voltage clamp), e viene misurata la corrente a livello della membrana. È anche possibile utilizzare un blocco della corrente (current clamp) per misurare le variazioni della tensione di membrana o potenziale di membrana. La variazione di tensione o di corrente nelle membrane cellulari può essere alterata mediante l’applicazione di composti per bloccare o aprire i canali. Queste tecniche permettono ai ricercatori di capire il comportamento dei canali ionici in condizioni sia fisiologiche che patologiche e di studiare in che modo diversi farmaci, ioni o altri analiti possono modificare tali condizioni.

Flusso di lavoro per il patch-clamp mediante l’uso di strumenti Axon

La gamma Axon Instruments® fornisce soluzioni complete per il patch-clamp e include amplificatori, digitalizzatore, software e accessori. I nostri strumenti all’avanguardia facilitano l’intera gamma di esperimenti basati sulle tecniche di patch-clamp, dalle più piccole registrazioni di singoli canali alle più ampie registrazioni macroscopiche. L’aggiunta del pacchetto software Axon pCLAMP 11 assicura un flusso di lavoro ottimizzato, permettendo di eseguire esperimenti efficienti e sofisticati e di ottenere dati di maggiore qualità. Scoprite di più sull’allestimento di un laboratorio di elettrofisiologia >

 

Elettrofisiologia patch-clamp

 

  1. Preparazione delle soluzioni – Preparare le soluzioni interne ed esterne. Regolare l’osmolarità e i valori di pH.

  2. Preparazione delle cellule o delle sezioni cerebrali – Preparare le cellule in coltura, i neuroni isolati, le sezioni cerebrali o gli animali interi.

  3. Forgiatura e levigatura della pipetta – Preparare l’elettrodo di registrazione. Forgiare il capillare in vetro e levigare la punta della pipetta.

  4. Allestimento del sistema di perfusione – Allestire il sistema di perfusione e configurare il software di acquisizione dati. Assicurarsi che il sistema sia schermato.

  5. Patch di una cellula – Utilizzare il manipolatore per posizionare la pipetta a contatto con la membrana cellulare. Assicurarsi che si formi un sigillo ad alta resistenza elettrica.

  6. Acquisizione e amplificazione del segnale – Il segnale verrà amplificato. Per risultati ottimali, è importante che venga utilizzato il tipo di amplificatore corretto per la propria ricerca.

  7. Digitalizzazione del segnale – Il segnale analogico viene quindi digitalizzato in modo da poter essere analizzato.

  8. Acquisizione e analisi dei dati – Con il pacchetto software pCLAMP 11 è possibile programmare protocolli più lunghi e più sofisticati per un’analisi dei dati più veloce e misurazioni precise.

 

Collegamenti rapidi ai principi di base dell’elettrofisiologia patch-clamp:

Scoprite di più sulle tecniche di patch-clamp, dalle registrazioni di singoli canali a quelle di un’intera cellula fino a quelle del potenziale di campo extracellulare.

  • Potenziale d’azione

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     Il potenziale d’azione consiste in un rapido aumento e una successiva diminuzione del voltaggio o potenziale di membrana attraverso la membrana cellulare con un pattern caratteristico. Esempi di cellule che comunicano mediante potenziali d’azione sono i neuroni e le cellule muscolari.

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    Analisi delle vie cellulari

     Analisi delle vie cellulari

    I canali ionici sono coinvolti in numerose vie cellulari e la comprensione della loro funzione in risposta alle variazioni del potenziale di membrana o alla presenza o assenza di altre molecole è importante per capire esattamente in che modo i canali ionici partecipano ai processi biologici fisiologici e patologici, come il differenziamento e la migrazione cellulare, gli stati di malattia e le comunicazioni neuronali.

  • cSEVC

    Cos’è il voltage-clamp a singolo elettrodo continuo (cSEVC)?

    Cos’è il voltage-clamp a singolo elettrodo continuo (cSEVC)? Si tratta di una metodica elettrofisiologica di patch-clamp che prevede il passaggio di un voltaggio di membrana in una cellula e la misurazione della modifica della corrente al variare del voltaggio.

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    Amplificatore per current-clamp

    Amplificatore per current-clamp

    Il current-clamp è un metodo utilizzato per misurare il potenziale di membrana (voltaggio) causato da un’iniezione di corrente. Per misurare il potenziale di membrana, i sistemi MultiClamp 700B e Axoclamp 900A monitorano entrambi il calo di voltaggio provocato dall’iniezione di corrente lungo un resistore in serie. Il current-clamp viene comunemente utilizzato per iniettare in una cellula forme d’onda di corrente simulate, ma realistiche e monitorarne l’effetto a livello della membrana. Questa tecnica è ideale per la valutazione di importanti eventi cellulari come i potenziali d’azione.

  • Acquisizione digitale

    Acquisizione digitale per elettrofisiologia patch-clamp

    Il segnale di corrente o di voltaggio acquisito dall’amplificatore è un segnale analogico, ma per eseguire l’analisi dei dati necessaria per le misurazioni di patch-clamp ad alta risoluzione, il segnale analogico deve essere convertito in un segnale digitale. Posizionato tra l’amplificatore e il computer, il digitalizzatore esegue questa importante operazione. La qualità del segnale è estremamente importante ed è influenzata dalla frequenza di campionamento. L’ultima generazione di digitalizzatori Digidata esegue il campionamento a 500 kHz e può essere equipaggiata con la funzione HumSilencer, che elimina il rumore alla frequenza di linea di 50/60 Hz.

    Ricerca sulle malattie

    Canali ionici utilizzati nella ricerca sulle malattie

    I canali ionici sono coinvolti in numerose malattie, tra cui ipertensione, aritmie cardiache, disturbi gastrointestinali, immunitari e neuromuscolari, dolore patologico e tumori. Mediante la comprensione del preciso ruolo svolto dai canali ionici in una determinata malattia, i ricercatori potrebbero essere in grado di trovare un modo per intervenire sui canali ionici allo scopo di alterare il decorso della malattia.

  • dSEVC

    Cos’è il voltage-clamp a singolo elettrodo discontinuo (dSEVC)?

     Nel voltage-clamp a singolo elettrodo discontinuo (discontinuous Single-Electrode Voltage Clamp, dSEVC), le operazioni di registrazione del voltaggio e di passaggio della corrente vengono eseguite attraverso la stessa micropipetta.

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    Elettrofisiologia

    Elettrofisiologia: Patch-clamp

    L’elettrofisiologia è il campo della ricerca che studia le variazioni di corrente o di voltaggio in una membrana cellulare. Le tecniche elettrofisiologiche sono ampiamente utilizzate in una gamma diversificata di applicazioni nel campo delle neuroscienze e della fisiologia, dalla comprensione del comportamento di singoli canali ionici in una membrana cellulare alle variazioni del potenziale di membrana che coinvolgono tutta la cellula alle modifiche su larga scala del potenziale di campo in sezioni cerebrali in vitro o in regioni cerebrali in vivo.

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  • Canali ionici

    Canali ionici

    Un canale ionico è costituito da un gruppo di proteine che formano un poro che attraversa il doppio strato lipidico di una cellula. Ogni canale è permeabile a uno ione specifico (ad esempio: potassio, sodio, calcio, cloruro). Il patch-clamp viene utilizzato per valutare la corrente o il voltaggio associati all’attività dei canali ionici a livello della membrana mediante la misurazione diretta in tempo reale tramite amplificatori ultrasensibili, sistemi di acquisizione dati di alta qualità e potenti software per valutare i risultati.

    Patch-clamp

    Tecniche di elettrofisiologia patch-clamp

    La tecnica del patch-clamp prevede l’uso di una micropipetta in vetro per formare un sigillo ermetico ad alta resistenza, nell’ordine dei gigaohm (GΩ), con la membrana cellulare. La micropipetta contiene un filo a bagno in una soluzione elettrolitica per condurre gli ioni. La tecnica su cellula intera comporta la rottura di un frammento di membrana mediante lieve aspirazione per fornire un accesso elettrico a bassa resistenza che permette di controllare il voltaggio transmembrana. In alternativa, i ricercatori possono staccare un frammento di membrana dalla cellula e valutare le correnti che passano attraverso singoli canali mediante la tecnica di patch-clamp con configurazione inside-out o outside-out.

  • Compensazione della resistenza in serie

    Compensazione della resistenza in serie mediante il metodo di registrazione su cellula intera

    La resistenza in serie è la somma di tutte le resistenze esistenti tra l’amplificatore e l’interno della cellula quando si usa il metodo di registrazione su cellula intera. In base alla legge di Ohm, quanto più alta è questa resistenza, tanto maggiore sarà la differenza tra il livello di comando e i valori misurati. Questo fenomeno determina un errore nella misurazione del voltaggio o della corrente effettivi, che potrebbe portare a osservazioni inaccurate. Per risolvere questo problema, gli amplificatori Molecular Devices sono dotati di circuiti integrati che migliorano l’ampiezza di banda della registrazione compensando l’errore introdotto dal calo di voltaggio o di corrente attraverso la resistenza in serie.

    Registrazione di singoli canali

    Tecnica di registrazione di singoli canali in patch-clamp

    La tecnica del patch-clamp prevede l’uso di una micropipetta in vetro per formare un sigillo ermetico ad alta resistenza, nell’ordine dei gigaohm, con la membrana cellulare. La micropipetta contiene un filo a bagno in una soluzione elettrolitica per condurre gli ioni. Per eseguire misurazioni su singoli canali ionici, un frammento (“patch”) di membrana viene staccato dalla cellula dopo aver formato un sigillo ad alta resistenza, nell’ordine dei gigaohm. Se nel frammento si trova un singolo canale ionico, è possibile misurare le correnti. L’amplificatore Axopatch 200B, che presenta un profilo di rumore estremamente basso, è ideale per questa applicazione, permettendo di aumentare al massimo il segnale dei canali ionici con conduttanza minima.

  • La guida Axon

    La guida Axon

    Una guida alle tecniche di laboratorio di biofisica ed elettrofisiologia. Lo scopo di questa guida è quello di servire come fonte di dati e informazioni per gli elettrofisiologi. Copre un’ampia gamma di argomenti che vanno dalle basi biologiche della bioelettricità e una descrizione dell’allestimento sperimentale di base a una discussione dei meccanismi del rumore e all’analisi dei dati.

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    Amplificatore per voltage-clamp

    Amplificatore per voltage-clamp

    In un esperimento basato sul metodo del voltage-clamp, il ricercatore controlla il voltaggio di membrana esistente in una cellula e misura la corrente transmembrana necessaria per mantenere tale voltaggio. Questo controllo del voltaggio è chiamato voltaggio di comando. Per mantenere questo livello di voltaggio di comando, un amplificatore deve iniettare corrente. La corrente iniettata sarà uguale e opposta alla corrente che fuoriesce attraverso i canali ionici aperti, permettendo all’amplificatore di misurare la quantità di corrente che passa attraverso i canali ionici aperti legati alla membrana.

  • Registrazione su cellula intera

    Tecnica di patch-clamp con registrazione su cellula intera

    La tecnica del patch-clamp su cellula intera prevede l’uso di una micropipetta in vetro per formare un sigillo ermetico ad alta resistenza, nell’ordine dei gigaohm (GΩ), con la membrana cellulare. Questa micropipetta contiene un filo a bagno in una soluzione elettrolitica per condurre gli ioni. Un frammento di membrana viene successivamente rotto mediante lieve aspirazione, in modo che la micropipetta in vetro crei un accesso a bassa resistenza all’intera cellula, permettendo al ricercatore di controllare il voltaggio transmembrana e di valutare la somma di tutte le correnti che passano attraverso i canali ionici legati alla membrana.

Ultime risorse

Risorse sull’elettrofisiologia

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