Elettrofisiologia patch-clamp
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Una guida completa alle tecniche di laboratorio di biofisica ed elettrofisiologia
Elettrofisiologia patch-clamp
La tecnica di patch-clamp è un versatile strumento elettrofisiologico per comprendere il comportamento dei canali ionici. I canali ionici sono presenti in tutte le cellule, ma quelle che vengono studiate più frequentemente mediante tecniche di patch-clamp sono i neuroni, le fibre muscolari, i cardiomiociti e gli ovociti con iperespressione di singoli canali ionici.
Per valutare la conduttanza di singoli canali ionici, un microelettrodo forma un sigillo ad alta resistenza con la membrana cellulare e viene rimosso un frammento di membrana cellulare contenente il canale ionico di interesse. In alternativa, mentre il microelettrodo forma il sigillo con la membrana cellulare, questo piccolo frammento può essere perforato per fornire all’elettrodo un accesso elettrico all’intera cellula. Viene poi applicata tensione, con formazione di un blocco del voltaggio (voltage clamp), e viene misurata la corrente a livello della membrana. È anche possibile utilizzare un blocco della corrente (current clamp) per misurare le variazioni della tensione di membrana o potenziale di membrana. La variazione di tensione o di corrente nelle membrane cellulari può essere alterata mediante l’applicazione di composti per bloccare o aprire i canali. Queste tecniche permettono ai ricercatori di capire il comportamento dei canali ionici in condizioni sia fisiologiche che patologiche e di studiare in che modo diversi farmaci, ioni o altri analiti possono modificare tali condizioni.
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Flusso di lavoro per il patch-clamp mediante l’uso di strumenti Axon
La gamma Axon Instruments® fornisce soluzioni complete per il patch-clamp e include amplificatori, digitalizzatore, software e accessori. I nostri strumenti all’avanguardia facilitano l’intera gamma di esperimenti basati sulle tecniche di patch-clamp, dalle più piccole registrazioni di singoli canali alle più ampie registrazioni macroscopiche. L’aggiunta del pacchetto software11 Axon pCLAMP assicura un flusso di lavoro ottimizzato, permettendo di eseguire esperimenti efficienti e sofisticati e di ottenere dati di maggiore qualità.
- Preparazione delle soluzioni: creare soluzioni interne ed esterne. Regolare l’osmolarità e i valori di pH.
- Preparazione di cellule o sezioni cerebrali: preparare le cellule in coltura, i neuroni isolati, le sezioni cerebrali o gli animali interi.
- Estrarre e lucidare la pipetta: preparare l’elettrodo di registrazione. Forgiare il capillare in vetro e levigare la punta della pipetta.
- Allestire il sistema di perfusione: allestire il sistema di perfusione e configurare il software di acquisizione dati. Assicurarsi che il sistema sia schermato.
- Patch di una cellula: utilizzare il manipolatore per posizionare la pipetta a contatto con la membrana cellulare. Assicurarsi che si formi un sigillo ad alta resistenza elettrica.
- Acquisizione e amplificazione del segnale: il segnale viene amplificato. Per risultati ottimali, è importante che venga utilizzato il tipo di amplificatore corretto per la vostra ricerca, Amplificatori per patch-clamp di Axon Instruments.
- Digitalizzazione del segnale: il segnale analogico viene poi digitalizzato in modo da poter analizzare il segnale, Axon™ Digidata® 1550B più HumSilencer®
- Acquisizione e analisi dei dati: con il pacchetto software 11 pCLAMP è possibile programmare protocolli più lunghi e più sofisticati per un’analisi dei dati più veloce e misurazioni precise.
Collegamenti rapidi ai principi di base dell’elettrofisiologia patch-clamp:
Scoprite di più sulle tecniche di patch-clamp, dalle registrazioni di singoli canali a quelle di un’intera cellula fino a quelle del potenziale di campo extracellulare.