Organoidi di carcinoma del colon-retto (CRC)
Organoidi di carcinoma del colon-retto derivati da pazienti
Gli organoidi derivati da pazienti (PDO) con carcinoma del colon-retto sono modelli di coltura cellulare tridimensionali (3D) che replicano la fisiologia dell’epitelio intestinale e le caratteristiche genetiche del paziente con CRC. Questi PDO di CRC modellano le interazioni tra cellule e l’afflusso di ossigeno e nutrienti all’interno del microambiente tumorale. Quando vengono coltivati in laboratorio, questi organoidi tumorali fungono da mini-repliche multicellulari del tumore 3D e hanno dimostrato la capacità di mantenere le loro caratteristiche in vivo.
Gli organoidi di CRC (e quelli di altri organi del corpo) sono derivati da cellule staminali adulte isolate da biopsie di pazienti. Il tessuto viene elaborato in laboratorio e inserito in una matrice gelatinosa di membrana basale che fornisce supporto fisico e fattori di crescita. Le cellule staminali all’interno del tessuto si dividono per formare più tipi di cellule (comprese altre cellule staminali) che si auto-assemblano in strutture tridimensionali che imitano la conformazione architettonica e la fisiologia del tumore originale. Una volta formate, queste strutture possono essere separate per riseminare diversi nuovi PDO che si auto-assemblano nello stesso modo. In questo modo, il numero di organoidi può essere ampliato per fornirne molti di più, a seconda delle necessità.
Vantaggi degli organoidi di carcinoma del colon-retto derivati da pazienti
La rappresentazione delle alterazioni genetiche associate al CRC e la composizione del tumore rendono i PDO di CRC ideali per la ricerca oncologica e la scoperta farmacologica. I PDO di CRC biologicamente rilevanti possono mostrare risposte ai farmaci simili a quelle dei pazienti, indicando il loro valore nel prevedere l’efficacia di nuovi composti terapeutici. Tuttavia, i tradizionali flussi di lavoro manuali di saggi sugli organoidi non si prestano allo screening riproducibile di composti ad alto rendimento per la scoperta farmacologica.
I progressi nell’espansione degli organoidi e nell’automazione dei saggi hanno contribuito a standardizzare i flussi di lavoro dei PDO di CRC. I nostri Organoidi 3D Ready sono prodotti in un ambiente industriale utilizzando la nostra tecnologia proprietaria di bioreattore e processi rigorosamente controllati. In un unico lotto si possono adesso generare molti milioni di organoidi standardizzati, di dimensioni costanti e di qualità testata. Gli organoidi di CRC sono crioconservati e possono essere utilizzati quando necessario per saggi ad alto rendimento. L’uso della manipolazione dei liquidi per seminare in piastra i PDO in piastre a più pozzetti e trattarli con i composti riduce in modo significativo gli errori e il tempo di lavoro. I cambiamenti in seguito al trattamento farmacologico possono essere valutati con saggi adeguati e analisi delle immagini.
Flusso di lavoro della coltura e del saggio del carcinoma del colon-retto
La valutazione degli effetti dei farmaci sui tumoroidi del colon-retto può essere automatizzata. Il flusso di lavoro sottostante illustra la valutazione automatizzata degli effetti dei composti antitumorali. L’ampliamento dei PDO si ottiene attraverso l’espansione in un bioprocesso che utilizza la tecnologia dei bioreattori. Dopo aver trattato gli organoidi con l’agente da testare, l’analisi morfologica viene eseguita con il sistema di imaging ad alto contenuto ImageXpress® Micro Confocal, mentre per il saggio di vitalità viene utilizzato il lettore per micropiastre SpectraMax® iD5 multimodale. Il flusso di lavoro comprende l’incubazione e la manipolazione automatizzata dei liquidi, nonché il software di programmazione per il trasferimento delle piastre dall’incubatore al manipolatore di liquidi e al lettore per piastre.
Protocollo sperimentale per i PDO di CRC
- Bioprocesso degli organoidi: i PDO di CRC vengono espansi manualmente e seminati nei bioreattori. Gli organoidi risultanti vengono conteggiati e valutati per determinare la loro gamma di dimensioni finali. Un numero definito di organoidi viene collocato in flaconcini e crioconservato, in modo da essere pronto per il saggio quando l’utente lo desidera.
- Scongelamento: i PDO vengono scongelati a 37°C, lavati con terreno fresco e suddivisi in pellet.
- Semina: i PDO sono sospesi nella matrice in idrogel o membrana basale richiesta per la semina di piastre a pozzetti multipli alla densità richiesta.
- Trattamento: 48 ore dopo la semina, i composti o gli agenti da testare possono essere applicati ai PDO nei pozzetti alle concentrazioni richieste.
- Imaging e analisi: l’imaging a luce trasmessa (Transmitted Light, TL) viene eseguito cinque giorni dopo il trattamento del composto per determinare i parametri desiderati, come il numero di organoidi, il diametro medio, il volume medio, l’area totale coperta dagli organoidi, la morfologia, ecc.
- Saggio di vitalità: un esempio di protocollo di saggio End-Point
- Reagente per il saggio di vitalità: un manipolatore di liquidi automatizzato viene utilizzato per aggiungere il reagente del saggio ai pozzetti per un saggio di vitalità cellulare ATP luminescente, mentre l’agitazione automatizzata della micropiastra media la lisi cellulare.
- Incubazione: l’incubazione viene eseguita a temperatura ambiente per 25 minuti.
- Saggio di vitalità cellulare ad ATP luminescente: per trasferire la micropiastra dall’incubatore al manipolatore di liquidi e al lettore per micropiastre, si utilizzano un software di programmazione e un manipolatore di campioni. I risultati vengono analizzati con il controllo del lettore per micropiastre e un software di analisi dei dati.
Offriamo ampie soluzioni di automazione di laboratorio per flussi di lavoro personalizzati di organoidi colorettali. Ogni fase, dalla coltura e semina degli organoidi alla manipolazione dei liquidi e all’acquisizione delle immagini, può essere automatizzata e combinata con le nostre soluzioni software di analisi dei dati, per generare rapporti conformi alle normative e pronti per la pubblicazione sui vostri saggi sugli organoidi.
Risorsa in primo piano
Una soluzione “in autonomia” per la valutazione degli effetti dei farmaci negli organoidi di carcinoma del colon-retto derivati da pazienti
In questo poster scientifico, gli organoidi di carcinoma del colon-retto derivati da pazienti sono stati coltivati e trattati con i composti antitumorali romidepsina, cisplatino, doxorubicina e trametinib.
L’imaging a luce trasmessa senza marcatura ha rivelato cambiamenti dipendenti dal numero di organoidi e dall’area totale occupata dagli organoidi in risposta al trattamento farmacologico. Il saggio ad ATP luminescente basato sul lettore per piastre ha permesso di ottenere dati quantitativi sulla vitalità cellulare degli organoidi.
Il flusso di lavoro prevede la manipolazione automatizzata dei liquidi, il trasferimento delle micropiastre e i metodi di analisi del software per ridurre il tempo di lavoro e accelerare lo screening dei farmaci.
Risorse recenti
La complessità delle strutture degli organoidi del colon-retto richiede strategie avanzate di imaging e di analisi. Inoltre, i passaggi laboriosi e dispendiosi in termini di tempo devono essere automatizzati per velocizzare i tempi e aumentare la coerenza. Scoprite come l’analisi qualitativa e quantitativa dei tumori ad alto rendimento può essere ottenuta attraverso strategie di automazione.