Analisi dell’apoptosi mediante imaging cellulare automatizzato

L’apoptosi è un processo di morte cellulare programmata importante in una varietà di processi biologici, tra cui lo sviluppo embrionale e il normale mantenimento dei tessuti. Alterazioni nella regolazione dell’apoptosi sono state implicate in varie malattie, compresi i tumori. Eventi biochimici determinano variazioni caratteristiche nella morfologia cellulare, quali raggrinzimento cellulare, frammentazione nucleare, condensazione della cromatina e degradazione dell’mRNA, e infine morte cellulare. L’apoptosi può avere inizio attraverso la via intrinseca o estrinseca, che inducono entrambe la morte cellulare mediante l’attivazione degli enzimi caspasi.

Uno dei metodi per analizzare l’apoptosi consiste nel rilevare la caspasi-3 e la caspasi-7, che si attivano entrambe durante la fase di esecuzione dell’apoptosi. Ad esempio, il kit del saggio EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488 contiene un substrato che permette di rilevare l’attività della caspasi-3/7 in cellule intatte. Il substrato è costituito da un colorante fluorogenico per il DNA accoppiato alla sequenza di riconoscimento DEVD della caspasi-3/7. Inizialmente non fluorescente, il substrato può attraversare la membrana plasmatica ed entrare nel citoplasma. Nelle cellule apoptotiche, la caspasi-3/7 scinde il substrato, provocando il rilascio del colorante ad alta affinità per il DNA, che migra nel nucleo della cellula e si lega al DNA. L’eccitazione a 500 nm determina l’emissione di un’intensa fluorescenza verde a 530 nm, che può essere utilizzata per valutare il livello di attivazione delle caspasi. Le cellule apoptotiche possono quindi essere visualizzate e quantificate mediante imaging automatizzato.

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Cellule HeLa sono state trattate con il composto staurosporina e colorate con il kit del saggio EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 (verde). La maschera di overlay (a destra) mostra le cellule apoptotiche identificate in verde e quelle non apoptotiche in rosso.

L’analisi delle immagini delle cellule apoptotiche può essere eseguita sul sistema di imaging cellulare automatizzato ImageXpress Pico, che dispone di un modello di protocollo preconfigurato per l’apoptosi concepito per una facile acquisizione e analisi delle immagini. È possibile calcolare automaticamente dati utili come il numero e la percentuale di cellule apoptotiche e di cellule vive. Di seguito è rappresentato un flusso di lavoro tipico per l’imaging e l’analisi di piastre per il saggio di apoptosi.

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Un flusso di lavoro tipico per l’imaging e l’analisi di cellule apoptotiche.

In sintesi, i benefici associati all’uso del sistema ImageXpress Pico per i saggi di apoptosi includono:

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