Polarizzazione della fluorescenza (PF)
La polarizzazione della fluorescenza (PF) è una tecnica usata diffusamente per monitorare gli eventi di legame in soluzione. Si può usare per valutare le interazioni biomolecolari, tra cui il legame proteina-anticorpo e l’ibridazione del DNA, così come l’attività enzimatica, ed è stata adattata alla ricerca di base e allo screening ad alto rendimento.
Una piccola molecola marcata in fluorescenza (tracciante) che viene eccitata con luce polarizzata linearmente emette principalmente luce depolarizzata perché il tracciante ruota rapidamente nel periodo tra l’eccitazione e l’emissione. Tuttavia, quando il tracciante si lega a una molecola molto più grande, ruota più lentamente e la luce emessa rimane ampiamente polarizzata.
Fattore G nella polarizzazione della fluorescenza
La polarizzazione, espressa in unità milliP o mP, viene calcolata a partire dalle misurazioni di intensità della fluorescenza perpendicolare (Iperp) e parallela (Ipara), valori rilevati in relazione alla direzione della luce di eccitazione polarizzata (vedere la formula qui di seguito). Il fattore G (G) viene utilizzato per correggere gli effetti di componenti ottici quali filtri, polarizzatori e monocromatori, che possono influire sui valori della polarizzazione.
Quanto maggiori sono le dimensioni della molecola marcata in fluorescenza, o della molecola a cui è legato il tracciante, tanto più elevato sarà il valore di mP.
Vantaggi della PF rispetto ad altri saggi di legame
La PF può essere utilizzata per studiare interazioni ligando-recettore, interazioni proteine-DNA, proteolisi, fluidità della membrana, saggi enzimatici e altro. I saggi di PF sono stati adoperati con successo per esaminare un’ampia varietà di target, tra cui chinasi, fosfatasi, proteasi, recettori accoppiati a proteina G (G Protein-Coupled Receptors, GPCR) e recettori nucleari.
I seguenti vantaggi rendono i saggi di PF particolarmente adatti per lo screening ad alto rendimento:
- Sono omogenei (nessun passaggio di lavaggio necessario)
- Non utilizzano radioattività
- Sono raziometrici (singola lunghezza d’onda)
- Sono miniaturizzabili
Saggi della fosfodiesterasi con tecnologia IMAP sui lettori per micropiastre multimodali SpectraMax
La tecnologia IMAP® di Molecular Devices consente di eseguire rapidi saggi omogenei non radioattivi su chinasi, fosfatasi e fosfodiesterasi ed è adatta sia per lo sviluppo di saggi che per lo screening ad alto rendimento. I saggi IMAP sono basati sul legame del fosfato a complessi di coordinazione metallici immobilizzati su nanoparticelle. Quando i gruppi di legame IMAP si legano al substrato fosforilato, il movimento molecolare del peptide viene alterato e la polarizzazione della fluorescenza (PF) della marcatura fluorescente legata al peptide aumenta (Figura 1, a sinistra). Nella versione per TR-FRET del saggio, l’inclusione di una molecola donatrice di terbio (Tb) permette il trasferimento di energia fluorescente quando è presente un substrato fosforilato (Figura 1, a destra). Questo saggio viene rilevato nella modalità a tempo risolto, che praticamente elimina l’interferenza della fluorescenza derivante dai composti o dai componenti del saggio in uno screening. Il TR-FRET offre anche flessibilità in termini di dimensioni e concentrazione del substrato.
Le fosfodiesterasi (Phosphodiesterases, PDE) dei nucleotidi ciclici sono un gruppo di enzimi che degradano il legame fosfodiesterico del cAMP e del cGMP, che sono secondi messaggeri coinvolti in una varietà di processi biologici. Questi enzimi si sono affermati come una classe importante di proteine utilizzabili come bersagli farmacologici a causa della loro rilevanza clinica in aree che includono cardiopatie, demenza, depressione e altro. Qui, dimostriamo come vengono generate le curve di diluizione e di inibizione degli enzimi PDE con la tecnologia IMAP utilizzando i lettori per micropiastre multimodali SpectraMax® con il software SoftMax® Pro.
Figura 1: Viene eseguita una reazione fosfodiesterasica utilizzando un substrato marcato in fluorescenza. Viene poi aggiunta la soluzione di legame contenente grandi nanoparticelle a base di M(III). Nella lettura in PF (a sinistra), il piccolo substrato fluorescente fosforilato si lega alle grandi nanoparticelle, per cui si verifica una riduzione della velocità rotazionale del substrato e un conseguente aumento della sua polarizzazione della fluorescenza. Nella lettura in modalità TR-FRET (a destra), il substrato fosforilato e il donatore di Tb si legano entrambi alla nanoparticella, per cui il donatore di Tb si avvicina all’accettore di fluoresceina sul substrato, permettendo che si verifichi il FRET.
Semplificazione del flusso di lavoro per la misurazione delle IgG nello sviluppo di linee cellulari
La misurazione della produzione di IgG è un passaggio cruciale in numerose fasi dello sviluppo e della produzione di anticorpi monoclonali. I metodi di uso comune per la quantificazione delle IgG richiedono personale qualificato e strumentazione specifica, come l’HPLC e l’interferometria di superficie, oppure saggi laboriosi come gli ELISA (saggi di immunoassorbimento enzimatico). Benché i saggi ELISA siano un metodo consolidato per la quantificazione delle proteine, richiedono una prolungata procedura con diversi passaggi. Qui presentiamo l’uso del saggio Valita®TITER di Valitacell per la misurazione dei titoli di IgG durante lo sviluppo di anticorpi e il processo di produzione.
Il saggio ValitaTITER è basato sulla rilevazione delle interazioni della regione Fc delle IgG con la proteina G utilizzando la tecnologia di polarizzazione della fluorescenza (PF). Ciascun pozzetto di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti viene rivestito con un peptide legante le IgG marcato in fluorescenza, la proteina G. Quando i campioni vengono aggiunti nei pozzetti, avviene la risospensione delle molecole di proteina G e si verifica il legame. La velocità di movimento molecolare della proteina G rallenta quando questa si lega agli anticorpi, determinando un aumento del valore di PF (Figura 2).
Figura 2: le molecole di proteina G libera sono più piccole e ruotano più velocemente nella soluzione tampone. Di conseguenza, la polarizzazione della luce di eccitazione polarizzata diminuisce (in alto). Quando le molecole di proteina G si legano agli anticorpi presenti nel campione, la rotazione di questo complesso più grande rallenta, determinando un aumento dei valori di PF (in basso).
Altre eccellenti risorse per i saggi di polarizzazione della fluorescenza
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Sviluppo e ottimizzazione di un saggio di polarizzazione della fluorescenza
Questa nota tecnica è concepita allo scopo di fornire informazioni per aiutare l’utente a definire le condizioni sperimentali ottimali per convertire i saggi esistenti in un solido formato basato sulla polarizzazione della fluorescenza. L’esempio è un saggio di legame competitivo del tipo spesso utilizzato per valutare il legame ligando-recettore. Si presume che l’utente abbia dimestichezza con i principi di base della polarizzazione della fluorescenza.
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Saggi IMAP PF per le chinasi
Le protein-chinasi sono essenziali per la regolazione di numerosi processi cellulari. Negli ultimi anni si sono rivelate come una delle classi più importanti di target farmacologici per i tumori e per molte altre malattie. La tecnologia IMAP® di Molecular Devices permette di eseguire rapidi saggi non radioattivi su un’ampia varietà di chinasi ed è adatta sia per lo sviluppo di saggi che per lo screening ad alto rendimento.
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Saggio IMAP per le fosfodiesterasi
La tecnologia IMAP offre una piattaforma omogenea non basata su anticorpi per lo screening di chinasi, fosfatasi e fosfodiesterasi. Stabile e affidabile, può essere miniaturizzata e produce dati di alta qualità con eccellenti valori del fattore Z’, una caratteristica che la rende adatta per lo screening di inibitori. A differenza di altri metodi, la tecnologia IMAP permette di misurare il legame diretto, fornendo risultati più rilevanti. I saggi IMAP TR-FRET consentono anche la determinazione diretta della Km.
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Tecnologia IMAP
Fino ad oggi, i saggi di attività chinasica sono stati eseguiti utilizzando isotopi radioattivi o anticorpi altamente specifici. Per far fronte a questo problema, Molecular Devices ha introdotto la sua tecnologia proprietaria IMAP®, che permette di eseguire saggi omogenei non radioattivi, applicabili a un’ampia varietà di chinasi senza tenere conto delle sequenze peptidiche del substrato. Il saggio prevede una semplice procedura “mix-and-read” che permette una determinazione accurata dell’attività enzimatica.
Tecnologia IMAP
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Saggio Transcreener ADP2
I saggi Transcreener® ADP2 sono saggi omogenei con letture in fluorescenza che consentono la rilevazione e lo screening di target farmacologici consolidati, tra cui chinasi di proteine e di lipidi, e di target emergenti come chinasi dei carboidrati, trifosfatasi, proteine heat shock e altre ATPasi. Il saggio è basato sull’immunorilevazione dell’ADP. Sono disponibili tre modalità di rilevazione per soddisfare le esigenze degli utenti e le loro preferenze in termini di formato di rilevazione: polarizzazione della fluorescenza (PF), trasferimento di energia per risonanza della fluorescenza (o di Förster) a tempo risolto (TR-FRET) e intensità della fluorescenza (IF).
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Saggio ValitaTITER
Il saggio ValitaTITER è un metodo omogeneo ad alto rendimento per la quantificazione rapida e precisa delle IgG nel flusso di lavoro per lo sviluppo di linee cellulari. Questo saggio a 96 pozzetti è stato totalmente validato sul lettore SpectraMax iD5 e su altri lettori per piastre di Molecular Devices con rilevazione basata sulla PF per garantire risultati affidabili. Il software SoftMax Pro riduce al minimo il tempo di configurazione necessario per la rilevazione ed esegue automaticamente l’adattamento della curva standard e la quantificazione del campione.
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