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TRF, TR-FRET e HTRF

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Panoramica della TRF/TR-FRET (HTRF)

Fluorescenza a tempo risolto (TRF)

Le misurazioni dell’intensità della fluorescenza (IF) utilizzano fluorofori standard come la fluoresceina, la cui emissione è di breve durata, dell’ordine dei nanosecondi. L’eccitazione del campione e la misurazione dell’emissione avvengono simultaneamente. Sebbene i lettori per micropiastre siano molto efficaci nell’escludere la luce di eccitazione dalla misurazione dell’emissione, tale luce di eccitazione, insieme alla luce di breve durata emessa dai materiali nel pozzetto o nel campione, spesso contribuisce a creare un background elevato.

La fluorescenza a tempo risolto (Time-Resolved Fluorescence, TRF) riduce il background utilizzando un fluoroforo lantanide, come l’europio o il terbio, che emette una fluorescenza di lunga durata. Questa fluorescenza di lunga durata ha una durata di millisecondi, quindi l’eccitazione del fluoroforo da parte di una sorgente di luce pulsata (ad esempio una lampada a flash), seguita da un ritardo e poi dalla misurazione del segnale (“finestra di conteggio”), permette l’attenuazione della fluorescenza di breve durata (che dura solo per nanosecondi) prima che venga effettuata una misurazione. I saggi che utilizzano la fluorescenza a tempo risolto presentano rapporti segnale/rumore notevolmente più alti. I lantanidi utilizzati più frequentemente sono l’europio, il terbio e il samario. Questi elementi sono comunemente usati come complessi chelati o criptati che offrono una buona intensità e stabilità del segnale.

 

 

Fluorescenza a tempo risolto (TRF)

Trasferimento di energia per risonanza della fluorescenza a tempo risolto (TR-FRET)

 

Trasferimento di energia per risonanza della fluorescenza a tempo risolto (TR-FRET)

assenza di FRET

Il donatore e l’accettore sono distanti

FRET

Il donatore e l’accettore sono molto vicini

La TR-FRET combina la misurazione della fluorescenza a tempo risolto (TR) con la tecnologia di trasferimento di energia per risonanza della fluorescenza (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET). Nei saggi FRET, le biomolecole (ad es. proteine) sono marcate con fluorofori donatori e accettori. Quando le biomolecole interagiscono, i fluorofori donatori e accettori si avvicinano. A questo punto, quando il donatore è eccitato, può trasferire la sua energia di emissione all’accettore, che a sua volta emette fluorescenza a una lunghezza d’onda specifica. Le emissioni di fluorescenza dell’accettore e del donatore hanno lunghezze d’onda diverse che possono essere distinte l’una dall’altra mediante un lettore per micropiastre, che permette di quantificare l’interazione biomolecolare.

Utilizzando fluorofori lantanidi, che presentano un’emissione di fluorescenza di lunga durata, come donatori, i saggi TR-FRET sfruttano la misurazione a tempo risolto della fluorescenza per eliminare la fluorescenza di fondo di breve durata. In un saggio TR-FRET, grazie all’emissione di lunga durata del fluoroforo donatore, l’eccitazione e l’emissione dei fluorofori donatore e accettore possono essere misurate anche dopo che la fluorescenza di fondo di breve durata si è attenuata.

Fluorescenza a tempo risolto omogenea (HTRF)

Fluorescenza a tempo risolto omogenea (HTRF)

L’HTRF è una versatile tecnologia TR-FRET sviluppata da Cisbio per la rilevazione delle interazioni biomolecolari. In un tipico saggio HTRF viene utilizzato criptato di europio come donatore e il fluoroforo organico d2 come accettore. Il donatore e l’accettore possono essere utilizzati per marcare una varietà di biomolecole per applicazioni che includono epigenetica, quantificazione di biomarcatori, vie di segnalazione di GPCR e molto altro. I saggi HTRF richiedono un lettore per micropiastre con modalità di rilevazione della TRF cha sia certificato come compatibile con l’HTRF da parte di Cisbio.

Progressi del cliente

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Vantaggi e considerazioni

I principali vantaggi della TRF e del TR-FRET includono la riduzione del background e l’aumento del rapporto segnale/rumore rispetto alla fluorescenza standard, che permettono di ottenere una maggiore sensibilità. Inoltre, il saggio presenta un solido formato “mix-and-read” che non richiede alcun lavaggio. Questa caratteristica, insieme alla stabilità del saggio, facilita l’automazione e la miniaturizzazione per applicazioni di screening.

 

Applicazioni e saggi

I saggi TRF e TR-FRET (HTRF) permettono l’analisi delle interazioni molecolari nei processi biochimici e sono ampiamente utilizzati per saggi chinasici e per studiare vie di segnalazione cellulare, interazioni proteina-proteina, interazioni DNA-proteine, citotossicità cellulare e legami recettore-ligando.

Nella tabella a destra sono riportati esempi di saggi basati su TR-FRET e in basso sono indicate varie risorse per la fluorescenza a tempo risolto.
 

Saggio Donatore Accettore Lunghezze d’onda
HTRF-Eu/red* Criptato di europio XL665 o d2 Ex320 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/red* Criptato di terbio XL665 o d2 Ex340 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/green* Criptato di terbio fluoresceina o GFP Ex340 Em1 620/Em2 520
Lanthascreen Tb** Chelato di terbio fluoresceina Ex340 Em1 490/Em2 520
Lanthascreen EU** Chelato di europio Alexa Fluor 647 Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE (originale)*** Chelato di europio Surelight® APC Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE Ultra*** Chelato di europio ULight Ex320 Em1 620/Em2 665

  • Saggi per le citochine

    Saggio HTRF per il TNFα umano

    Le citochine proinfiammatorie e antinfiammatorie svolgono un ruolo fondamentale nelle malattie autoimmuni, infiammatorie e infettive. Inoltre, sono elementi importanti anche nei disturbi metabolici e in campo oncologico, in particolare nella risposta immunitaria antitumorale. I saggi HTRF rappresentano una versatile piattaforma per la quantificazione di varie citochine e chemochine e sono adatti per il monitoraggio del rilascio di citochine e chemochine negli esperimenti basati su cellule. Con il lettore per micropiastre multimodale SpectraMax i3x e il citometro per imaging SpectraMax® MiniMax™ 300, gli utenti possono misurare l’HTRF e la vitalità cellulare e possono anche confermare la qualità dei saggi monitorando l’aspetto delle cellule.

    Scoprite le nostre risorse per i saggi sulle citochine:

    eBook: Dall'ELISA all'epigenetica con HTRF

    ELISA to epigenetics with HTRF

    Come superare le difficoltà associate alla rilevazione dell’HTRF con impostazione ottimizzate del lettore per micropiastre e un’analisi semplificata.

    eBook: From ELISA to epigenetics with HTRF

  • Saggi HTRF per il cAMP, recettori accoppiati a Gαi/o

    Saggi HTRF cAMP dynamic 2 e IP-One

    L’AMP ciclico (cAMP, adenosina 3’, 5’-monofosfato ciclico) è un secondo messaggero fondamentale nelle vie di segnalazione dei GPCR. La generazione di cAMP è probabilmente la via di trasduzione del segnale più studiata ed è coinvolta nelle risposte a input sensoriali, ormoni, trasmissione nervosa e molto altro. Dopo il legame di un ligando a un GPCR, si verifica una modifica conformazionale che attiva il recettore, che a sua volta attiva una proteina G. L’attivazione dei recettori accoppiati a proteina Gαi/o inibisce la formazione di cAMP da parte dell’adenilato ciclasi.

    Scoprite le nostre risorse per le proteine Gαi/o

    Saggi HTRF per il cAMP, recettori accoppiati a Gαs

    Saggi HTRF per il cAMP

    L’AMP ciclico (cAMP, adenosina 3’, 5’-monofosfato ciclico) è un secondo messaggero fondamentale nelle vie di segnalazione dei GPCR. La generazione di cAMP è probabilmente la via di trasduzione del segnale più studiata ed è coinvolta nelle risposte a input sensoriali, ormoni, trasmissione nervosa e molto altro. Dopo il legame di un ligando a un GPCR, si verifica una modifica conformazionale che attiva il recettore, che a sua volta attiva una proteina G. L’ulteriore trasduzione del segnale dipende dal tipo di proteina G attivata, ma l’attivazione di Gαs determina la sovraregolazione del cAMP da parte dell’adenilato ciclasi.

    Scoprite le nostre risorse per le proteine Gαs

  • Saggio HTRF

    Saggio HTRF

    I saggi di HTRF di Cisbio si sono evoluti per includere nuove aree, tra cui recettori accoppiati a proteina G, chinasi e segnalazione cellulare, epigenetica e biomarcatori. È disponibile un’ampia varietà di combinazioni di kit e di reagenti per studiare le interazioni proteina-proteina ed eseguire saggi su recettori nucleari, dimerizzazione dei recettori, legame dei ligandi, internalizzazione dei recettori, enzimi e molto altro.

    L’HTRF prevede l’uso di due fluorofori, uno che funge da donatore e l’altro da accettore, per marcare le proteine o altre biomolecole di interesse. Quando le biomolecole interagiscono, la loro prossimità permette che si verifichi il trasferimento di energia per risonanza della fluorescenza (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) dal fluoroforo donatore al fluoroforo accettore. L’uso di criptati dei lantanidi che emettono fluorescenza di lunga durata come donatori consente la rilevazione a tempo risolto dei saggi HTRF, riducendo al minimo la fluorescenza di fondo di breve durata emessa dai composti e da altri materiali. La rilevazione del FRET a tempo risolto (TR-FRET) con un lettore per micropiastre fornisce un’indicazione del legame biomolecolare.

    Lettori per micropiastre compatibili con l’HTRF

    Lettori per micropiastre compatibili con l’HTRF

    Per ottenere risultati ottimali con l’HTRF è necessario un lettore per micropiastre che sia stato validato per soddisfare le specifiche prestazionali per l’HTRF definite da Cisbio. L’ottica, la fonte di energia e i rilevatori di un lettore, così come le impostazioni utilizzate per rilevare l’HTRF, sono tutti fattori che influenzano le prestazioni. I nostri lettori utilizzano componenti ottimizzati per la rilevazione dell’HTRF, compresa un’apposita cartuccia di rilevazione per i lettori per micropiastre multimodali SpectraMax i3x e Paradigm e un modulo TRF potenziato combinato con filtri validati per il lettore SpectraMax iD5.

    Il programma di certificazione dell’HTRF di Cisbio garantisce che i lettori contrassegnati con il logo “HTRF compatible” soddisfano le specifiche necessarie per prestazioni HTRF ottimali. Questa nota tecnica presenta le impostazioni ottimizzate validate da Cisbio per i lettori per micropiastre HTRF-compatibili di Molecular Devices.

  • Saggi IP-One, recettori accoppiati a Gαq/11

    Saggi IP-One, recettori accoppiati a Gαq/11

    La fosfolipasi C (PLC) è un altro target comune delle proteine G attivate e svolge un ruolo cruciale in una varietà di processi. Ad esempio, i recettori della trombina nelle piastrine utilizzano questa via per promuovere la coagulazione del sangue. Gli immunodosaggi competitivi IP-One di Cisbio permettono di rilevare l’accumulo di inositolo monofosfato (IP1), un metabolita stabile a valle dell’IP3 indotto dalla stimolazione della PLC in seguito all’attivazione del recettore accoppiato a proteina Gαq/11. Questo kit permette la caratterizzazione diretta degli agonisti e degli antagonisti del recettore in cellule sia aderenti che in sospensione.

    Saggi delle chinasi e di epigenetica

    Saggi delle chinasi e di epigenetica

    Le protein-chinasi sono enzimi che svolgono un ruolo importante in varie vie di trasduzione del segnale coinvolte nel controllo della crescita cellulare, del metabolismo, del differenziamento e dell’apoptosi. Le chinasi rappresentano il secondo gruppo più importante di target farmacologici dopo i GPCR. L’epigenetica è lo studio delle variazioni fenotipiche ereditarie che non comportano alterazioni nelle sequenze nucleotidiche, come ad esempio la metilazione del DNA e la modifica degli istoni. Questi meccanismi sono stati associati allo sviluppo di varie malattie, in particolare dei tumori.

    Scoprite le nostre risorse per i saggi delle chinasi e di epigenetica:

  • Misurazione del metabolismo ossidativo e dell’attività glicolitica

    Misurazione del metabolismo ossidativo e dell’attività glicolitica

    Per sopravvivere, le cellule richiedono carburante sotto forma di ATP per eseguire la maggior parte dei bioprocessi essenziali. Questo carburante viene generato attraverso la glicolisi e la respirazione mitocondriale. Benché entrambi questi processi producano ATP, la glicolisi può avvenire in assenza di ossigeno, mentre i mitocondri hanno bisogno di ossigeno per la fase finale della fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Capire in che modo queste vie rispondono ai composti effettori può fornire informazioni utili sul funzionamento generale delle cellule e sui meccanismi sottostanti che ne determinano il destino.

    Leggete la nostra nota applicativa per approfondire le vostre conoscenze sull’acquisizione di dati in tempo reale e sull’analisi dell’evoluzione del consumo di ossigeno e dell’attività glicolitica:

    Impostazioni ottimizzate per i saggi TR-FRET Transcreener

    Saggi TR-FRET Transcreener

    I saggi TR-FRET Transcreener® sono immunodosaggi competitivi in un unico passaggio per la rilevazione diretta di nucleotidi con letture di trasferimento di energia per risonanza della fluorescenza (o di Förster) a tempo risolto (Time-Resolved Förster Resonance Energy Transfer, TR-FRET) nel rosso lontano. Scoprite come ottimizzare le impostazioni per i saggi TR-FRET Transcreener sui lettori per micropiastre multimodali SpectraMax iD5 e i3x.

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