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Elettrofisiologia

La casa della famosa guida Axon:

Una guida alle tecniche di laboratorio di biofisica ed elettrofisiologia

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Cos’è l’elettrofisiologia?

L’elettrofisiologia è il campo della ricerca che studia le variazioni di corrente o di voltaggio in una membrana cellulare.

Le tecniche elettrofisiologiche sono ampiamente utilizzate in una gamma diversificata di applicazioni nel campo delle neuroscienze e della fisiologia, dalla comprensione del comportamento di singoli canali ionici in una membrana cellulare alle variazioni del potenziale di membrana che coinvolgono tutta la cellula fino alle modifiche su larga scala del potenziale di campo in sezioni cerebrali in vitro o in regioni cerebrali in vivo.

Il patch-clamp, una delle tecniche di elettrofisiologia più diffuse, è lo strumento migliore per studiare l’attività dei canali ionici, che rappresentano bersagli importanti per i ricercatori a causa del ruolo fondamentale che svolgono in numerose malattie neurologiche e cardiovascolari e delle loro funzioni fisiologiche.

La registrazione del potenziale di campo extracellulare può essere utilizzata per esaminare l’attività sinaptica di una popolazione di neuroni e può aiutarci a capire come vengono elaborate le informazioni nel cervello.

 

Laboratorio di elettrofisiologia

L’allestimento di ogni laboratorio di elettrofisiologia è diverso e riflette i requisiti dell’esperimento o gli aspetti che lo sperimentatore ritiene più importanti. Qui descriviamo componenti e considerazioni comuni a tutti gli allestimenti dedicati alla misurazione dell’attività elettrica nelle cellule. L’allestimento di un laboratorio di elettrofisiologia presenta quattro aspetti principali:

  1. Ambiente: il mezzo per il mantenimento della preparazione in condizioni sane;

  2. Ottica: un mezzo per la visualizzazione della preparazione;

  3. Meccanica: un mezzo per il posizionamento stabile del microelettrodo; e

  4. Elettronica: un mezzo per l’amplificazione e la registrazione del segnale.

 

L’illustrazione qui di seguito mostra un allestimento standard di apparecchiature per elettrofisiologia: un tavolo e una gabbia per schermare l’allestimento dalle interferenze esterne; un microscopio con micromanipolatore per il posizionamento stabile del microelettrodo; un amplificatore per la raccolta e l’amplificazione dei segnali acquisiti; un digitalizzatore per la conversione dei segnali analogici in segnali digitali e un software di acquisizione e analisi dei dati per la configurazione dei protocolli sperimentali e l’estrazione di risultati significativi e di immediato valore pratico a partire dai dati raccolti.

 

Apparecchiatura per patch-clamp

Soluzione per elettrofisiologia: apparecchiature Axon

La gamma di strumenti Axon™ fornisce una soluzione completa per il patch-clamp e include amplificatori, digitalizzatore, software e accessori. I nostri strumenti all’avanguardia facilitano l’intera gamma di tecniche elettrofisiologiche di patch-clamp, dalle più piccole registrazioni di singoli canali alle più ampie registrazioni macroscopiche.

Il pacchetto software Axon pCLAMP™ 11 è il programma di acquisizione e analisi dei dati di elettrofisiologia più ampiamente utilizzato per il controllo e la registrazione di esperimenti di voltage-clamp, current-clamp e patch-clamp. Numerose funzioni chiave elencate di seguito aiutano a ottimizzare il flusso di lavoro, permettendo di realizzare esperimenti più sofisticati, di eseguirli in modo più efficiente e di generare dati di migliore qualità.

 

Cos’è un amplificatore per patch-clamp? È uno strumento che contiene i circuiti necessari per misurare le correnti elettriche che passano attraverso i canali ionici o le variazioni di potenziale della membrana cellulare.

Perché viene utilizzato? Per misurare variazioni di corrente o di voltaggio. L’amplificatore contiene i circuiti necessari per misurare la corrente che passa attraverso la membrana cellulare sia in termini di intensità che di direzione.

L’amplificatore permette anche di misurare il potenziale della membrana cellulare in risposta al movimento della corrente. Per dare inizio al movimento della corrente, lo sperimentatore può somministrare un comando di voltaggio alla cellula e la cellula risponderà facendo passare la corrente necessaria per mantenere tale comando di voltaggio. In alternativa, lo sperimentatore può anche iniettare corrente e poi misurare la modifica del potenziale di membrana causato da tale variazione di corrente. La scelta del punto in cui amplificare e filtrare il segnale di interesse ha implicazioni sulla fedeltà del segnale. La posizione ideale per amplificare il segnale è all’interno dello strumento di registrazione. Tutti i modelli di amplificatori Axon™ utilizzano questa strategia con controllo variabile del guadagno sul segnale in uscita per garantire un’amplificazione a basso rumore della corrente della pipetta o del potenziale di membrana. Il posizionamento dell’amplificazione all’interno dello strumento di registrazione riduce al minimo l’estensione del circuito tra il segnale a basso livello e il circuito di amplificazione, limitando le fonti di rumore esterne.

Amplificatori disponibili: Axopatch™ 200B, MultiClamp™ 700B, Axoclamp™ 900A

Cos’è? Il digitalizzatore è uno strumento per l’acquisizione di dati che converte segnali analogici in segnali digitali.

Perché viene utilizzato? I digitalizzatori acquisiscono dati per l’analisi.

Il segnale di corrente acquisito dall’amplificatore è un segnale analogico, ma per eseguire l’analisi dei dati necessaria per le misurazioni di patch-clamp ad alta risoluzione, il segnale analogico deve essere convertito in un segnale digitale. Posizionato tra l’amplificatore e il computer, il digitalizzatore esegue questa importante operazione. La qualità del segnale ricevuto dal computer è estremamente importante ed è determinata dalla frequenza di campionamento o tasso di campionamento. L’ultima generazione di digitalizzatori Digidata® ha la capacità di eseguire il campionamento a 500 kHz ed è equipaggiata con la funzione HumSilencer™, che permette di eliminare il rumore alla frequenza di linea di 50/60 Hz.

Amplificatori disponibili: Sistema di acquisizione dati a basso rumore Digidata 1550B più HumSilencer

Cos’è? Il software di acquisizione e analisi dei dati di patch-clamp è la vostra interfaccia con l’amplificatore, il digitalizzatore e qualsiasi altro componente elettronico per patch-clamp.

Perché viene utilizzato? Per eseguire l’acquisizione e l’analisi dei dati e per controllare il digitalizzatore e l’amplificatore.

Mentre l’insieme dell’amplificatore e del digitalizzatore contiene i circuiti chiave per l’esecuzione di un esperimento di patch-clamp, il software controlla questi strumenti in modo che somministrino il potenziale desiderato e misurino la corrente o il voltaggio risultanti. Inoltre, il software analizza i dati acquisiti con le impostazioni definite dall’utente, che possono includere filtrazione, normalizzazione, rimozione del rumore, adattamento della curva e determinazione dei parametri.

Amplificatori disponibili: Software pCLAMP™ 11

Cos’è? Dispositivo che contiene le micropipette con circuiti integrati per la trasmissione dei segnali elettrici dalle micropipette all’amplificatore.

Perché viene utilizzato? Il segnale elettrico acquisito dalla micropipetta deve essere trasmesso ai sistemi di amplificazione per l’elaborazione del segnale.

Ogni headstage è specificamente regolato per l’amplificatore. Tutti gli headstage contengono circuiti elettrici critici che riducono il rumore. Gli headstage sono anche controllati meccanicamente dal micromanipolatore.

Headstage disponibili: headstage Axon

Cos’è? Il microscopio è uno strumento di ingrandimento ottico. Il micromanipolatore è un dispositivo che manovra meccanicamente la micropipetta con precisione nanometrica, permettendo solitamente di eseguire movimenti nelle 3 dimensioni.

Perché viene utilizzato? Per posizionare in modo stabile e preciso la micropipetta nell’area della membrana cellulare, che è un aspetto cruciale per una registrazione efficace.

Il posizionamento accurato di un elettrodo di patch su una cellula di 10-20 µm richiede un sistema ottico in grado di garantire un ingrandimento di fino a 300 o 400 volte con miglioramento del contrasto (ad es. Nomarski/DIC, Phase o Hoffman) e un micromanipolatore che permetta di posizionare stabilmente l’elettrodo nello spazio 3D. È preferibile utilizzare un microscopio invertito perché consente di accedere più facilmente agli elettrodi dal di sopra della preparazione e offre anche una piattaforma più ampia e più solida per fissare il micromanipolatore. Un micromanipolatore ha la capacità di muovere l’elettrodo per distanze molto piccole lungo gli assi X, Y e Z. Inoltre, permette poi di mantenere tale posizione a tempo indefinito.

Cos’è? Un tavolo e una gabbia intorno all’allestimento di patch-clamp per isolare le fonti di interferenza.

Perché viene utilizzato? Per schermare l’allestimento dalle interferenze esterne.

Le correnti elettriche misurate durante gli esperimenti di patch-clamp possono essere estremamente piccole (nell’ordine dei picoampere) e qualsiasi minima fonte di interferenza, come le onde radio, può distorcere o nascondere questi segnali. Una gabbia di Faraday è una struttura costituita da una rete metallica posta intorno al microscopio e alla camera di registrazione; è utile per evitare che gli elettrodi captino fonti di rumore esterne. Inoltre, piccole fonti di vibrazioni nell’ordine dei picometri possono disturbare la registrazione. Pertanto, tutti i componenti devono essere perfettamente posizionati nel corso dello svolgimento dell’esperimento e vengono utilizzati tavoli ad aria o anti-vibrazioni per isolare l’allestimento dalle fonti esterne di vibrazione che potrebbero compromettere questo allineamento.

Webinar on-demand

Risparmiate tempo nell’analisi dei dati con la nuova funzione di analisi in batch del software Axon pCLAMP 11

Relatore: Jeffrey Tang, Ph.D.

Senior application scientist per l’elettrofisiologia globale Axon

Jeffrey Tang

Registratevi per il nostro webinar on-demand per scoprire come utilizzare il modulo software Clampfit per manipolare e analizzare i dati di elettrofisiologia acquisiti con il software Axon pCLAMP™ 11. Le avanzate macro di analisi in batch del software eliminano la necessità di definire parametri per ogni set, ottimizzando l’analisi dei dati. Il dott. Jeffrey Tang eseguirà una panoramica delle nuove funzioni di analisi in batch e illustrerà l’uso delle macro, l’analisi dei dati in batch e l’elaborazione di grafici.

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  • La guida Axon

    La guida Axon

    Una guida alle tecniche di laboratorio di biofisica ed elettrofisiologia. Lo scopo di questa guida è quello di servire come fonte di dati e informazioni per gli elettrofisiologi. Copre un’ampia gamma di argomenti che vanno dalle basi biologiche della bioelettricità e una descrizione dell’allestimento sperimentale di base a una discussione dei meccanismi del rumore e all’analisi dei dati.

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    Rilevazione automatica degli eventi

    Rilevazione automatica di eventi con Clampfit

    Il modulo di analisi avanzata Clampfit, che è parte integrante del pacchetto software pCLAMP 11, è dotato di un flessibile motore di rilevazione degli eventi che analizza i potenziali d’azione spontanei ed evocati e i dati post-sinaptici. Gli eventi vengono rilevati in base al superamento di una soglia o mediante uno strumento di ricerca di modelli con pattern corrispondenti. La ricerca di modelli permette di analizzare eventi spontanei come EPSP e IPSP sinaptici in miniatura. Inoltre, è possibile rilevare simultaneamente varie categorie di eventi. L’ambiente integrato del software Clampfit 11 collega gli eventi rilevati nei dati con le finestre dei fogli di calcolo e dei grafici, permettendo una rapida valutazione contestualizzata dell’intero set di dati.

  • Analisi dei dati in batch

    Macro per l’analisi in batch dei dati

    Il modulo di analisi avanzata Clampfit, che è parte integrante del pacchetto software pCLAMP 11, contiene uno strumento di analisi dei dati in batch che utilizza macro per accelerare l’analisi dei dati. L’analisi in batch permette di risparmiare tempo attraverso l’analisi di grandi quantità di dati creati dallo stesso protocollo. Per utilizzare l’analisi in batch, è sufficiente attivare la funzione di acquisizione macro, analizzare i dati e salvare la macro. Quando occorre analizzare ulteriori dati, è sufficiente applicare la macro salvata e i dati vengono analizzati automaticamente.

    Suggerimenti tecnici con Jeffrey Tang: Funzione del software Axon pClamp™ 11 per l’analisi in batch

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    Storia del cliente: Università del Texas

    L’Università del Texas utilizza il patch-clamp Axon

    L’Università del Texas utilizza sistemi per patch-clamp Axon per valutare i meccanismi di segnalazione responsabili della memoria e del richiamo a livello cerebrale

    “Il bello dei protocolli disponibili in Clampex (un modulo incluso nel software pCLAMP) è che è possibile programmare il proprio sistema in modo da controllare sia la stimolazione che la registrazione, il che rende l’intero sistema unico e potente. Ancor più importante è la versatilità, poiché è possibile immettere numerose strategie di stimolazione diverse, tutte sotto il controllo di Clampex.”

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  • Strumento di ricerca di spike di popolazione

    Le registrazioni di spike di popolazione e gli esperimenti con impulsi appaiati, anche se semplici da acquisire, risultano tradizionalmente difficili da analizzare. Grazie al modulo di analisi avanzata Clampfit del software pCLAMP 11, non è più così. Lo strumento di ricerca di spike di popolazione localizzerà automaticamente gli spike di popolazione in base ai parametri definiti dall’utente e calcolerà ampiezza, area sotto la curva, semi-larghezza, tempo e pendenza della fase di salita e di discesa, contorno degli spike di popolazione e impulsi appaiati.

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    Tecnologia HumSilencer

    Tecnologia HumSilencer

    Il rumore alla frequenza di linea di 50/60 Hz, anche noto come rumore elettrico, è la più comune fonte di rumore di fondo negli esperimenti di elettrofisiologia patch-clamp. Questo rumore può coprire i segnali biologici di interesse, rendendo quasi impossibile l’esecuzione di misurazioni sensibili di patch-clamp. Generalmente, le procedure tradizionali di risoluzione dei problemi sono solo parzialmente efficaci e possono compromettere l’accuratezza dei dati. HumSilencer è una tecnologia adattativa priva di filtri che impara e rimuove il rumore alla frequenza di linea senza utilizzare metodi che compromettono l’accuratezza del segnale, come i filtri, che possono provocare distorsioni dei segnali biologici.

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  • Analisi del potenziale d’azione

    Ricerca del potenziale d’azione del patch-clamp per eventi cellulari

    I potenziali d’azione rappresentano importanti eventi cellulari. Senza i potenziali d’azione, il cuore non batterebbe e i neuroni non trasmetterebbero gli impulsi, per cui la misurazione di questi eventi è essenziale. Lo strumento di ricerca di potenziali d’azione nel modulo avanzato Clampfit 11 permette di rilevare tutti i potenziali d’azione nel file di dati. Utilizza parametri definiti dall’utente e determinati a livello di programmazione, tra cui ampiezza, durata del potenziale d’azione, tempo e pendenza della fase di salita e di discesa, tempo e frequenza picco-picco, delta di ampiezza per picco, ampiezza e durata del post-potenziale e potenziale di soglia.

    Suggerimenti tecnici con Jin Yan: Funzione del software Axon pClamp™ 11 per l’analisi del potenziale d’azione

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    Sincronizzazione degli studi di elettrofisiologia e di imaging

    Sincronizzazione degli studi di elettrofisiologia e di imaging

    Nella ricerca sulle cellule vive è sempre più pressante la necessità di utilizzare simultaneamente modalità complementari di acquisizione dei dati per descrivere i processi intracellulari. Le registrazioni simultanee con tecniche di imaging e di elettrofisiologia forniscono una utile correlazione tra questi due tipi di dati e sono state ampiamente utilizzate per esaminare una varietà di risposte cellulari.

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  • Storia del cliente: Allegheny College

    Allegheny College

    L’Allegheny College utilizza i nostri strumenti per patch-clamp Axon per studiare il blocco dei canali ionici da parte del peptide beta amiloide nella malattia di Alzheimer

    La dott.ssa Lauren French lavora con studenti universitari all’Allegheny College per scoprire in che modo il peptide beta amiloide implicato nella malattia di Alzheimer inibisce i canali del potassio attivati dal calcio. Questa interazione dei canali è stata descritta da Yamamoto et al. (2011), e gli studenti nel suo laboratorio la stanno studiando mediante il sistema di espressione in ovociti di Xenopus.

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    Galleria di video sul patch-clamp Axon

    Galleria di video sul patch-clamp Axon

    Visitate la nostra galleria di video sul patch-clamp Axon per i più recenti video, webinar e tutorial in primo piano sui nostri strumenti Axon, tra cui gli amplificatori per patch-clamp Axon, il digitalizzatore Digidata 1550B più HumSilencer e il pacchetto software pCLAMP.

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  • Elettrofisiologia patch-clamp

    Elettrofisiologia patch-clamp

    La tecnica del patch-clamp è un versatile strumento elettrofisiologico per comprendere il comportamento dei canali ionici. I canali ionici sono presenti in tutte le cellule, ma quelle che vengono studiate più frequentemente mediante tecniche di patch-clamp sono i neuroni, le fibre muscolari, i cardiomiociti e gli ovociti con iperespressione di singoli canali ionici. Qui potete scoprire di più sull’elettrofisiologia patch-clamp e imparare nozioni di base sui canali ionici.

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Ultime risorse

Risorse sull’elettrofisiologia

Video e webinar

Suggerimenti di Jeffrey Tang

Suggerimenti tecnici con Jeffrey Tang: Funzione del software Axon pCLAMP™ 11 per l’analisi in batch

Suggerimenti tecnici con Jin Yan

Suggerimenti tecnici con Jin Yan: Funzione del software Axon pClamp™ 11 per l’analisi del potenziale d’azione

Analisi di spike di popolazione in pCLAMP 11

Analisi di spike di popolazione in pCLAMP 11

Macro per l’analisi in batch dei dati di Molecular Devices

Macro per l’analisi in batch dei dati