Elettrofisiologia
La casa della famosa guida Axon:
Una guida alle tecniche di laboratorio di biofisica ed elettrofisiologia
Cos’è l’elettrofisiologia?
L’elettrofisiologia è il campo della ricerca che studia le variazioni di corrente o di voltaggio in una membrana cellulare.
Le tecniche elettrofisiologiche sono ampiamente utilizzate in una gamma diversificata di applicazioni nel campo delle neuroscienze e della fisiologia, dalla comprensione del comportamento di singoli canali ionici in una membrana cellulare alle variazioni del potenziale di membrana che coinvolgono tutta la cellula fino alle modifiche su larga scala del potenziale di campo in sezioni cerebrali in vitro o in regioni cerebrali in vivo.
Il patch-clamp, una delle tecniche di elettrofisiologia più diffuse, è lo strumento migliore per studiare l’attività dei canali ionici, che rappresentano bersagli importanti per i ricercatori a causa del ruolo fondamentale che svolgono in numerose malattie neurologiche e cardiovascolari e delle loro funzioni fisiologiche.
La registrazione del potenziale di campo extracellulare può essere utilizzata per esaminare l’attività sinaptica di una popolazione di neuroni e può aiutarci a capire come vengono elaborate le informazioni nel cervello.
Laboratorio di elettrofisiologia
L’allestimento di ogni laboratorio di elettrofisiologia è diverso e riflette i requisiti dell’esperimento o gli aspetti che lo sperimentatore ritiene più importanti. Qui descriviamo componenti e considerazioni comuni a tutti gli allestimenti dedicati alla misurazione dell’attività elettrica nelle cellule. L’allestimento di un laboratorio di elettrofisiologia presenta quattro aspetti principali:
- Ambiente: il mezzo per il mantenimento della preparazione in condizioni sane;
- Ottica: un mezzo per la visualizzazione della preparazione;
- Meccanica: un mezzo per il posizionamento stabile del microelettrodo; e
- Elettronica: un mezzo per l’amplificazione e la registrazione del segnale.
L’illustrazione qui di seguito mostra un allestimento standard di apparecchiature per elettrofisiologia: un tavolo e una gabbia per schermare l’allestimento dalle interferenze esterne; un microscopio con micromanipolatore per il posizionamento stabile del microelettrodo; un amplificatore per la raccolta e l’amplificazione dei segnali acquisiti; un digitalizzatore per la conversione dei segnali analogici in segnali digitali e un software di acquisizione e analisi dei dati per la configurazione dei protocolli sperimentali e l’estrazione di risultati significativi e di immediato valore pratico a partire dai dati raccolti.
Soluzione per elettrofisiologia: apparecchiature Axon
La gamma di strumenti Axon™ fornisce una soluzione completa per il patch-clamp e include amplificatori, digitalizzatore, software e accessori. I nostri strumenti all’avanguardia facilitano l’intera gamma di tecniche elettrofisiologiche di patch-clamp, dalle più piccole registrazioni di singoli canali alle più ampie registrazioni macroscopiche.
Il pacchetto software Axon pCLAMP™ 11 è il programma di acquisizione e analisi dei dati di elettrofisiologia più ampiamente utilizzato per il controllo e la registrazione di esperimenti di voltage-clamp, current-clamp e patch-clamp. Numerose funzioni chiave elencate di seguito aiutano a ottimizzare il flusso di lavoro, permettendo di realizzare esperimenti più sofisticati, di eseguirli in modo più efficiente e di generare dati di migliore qualità.
AMPLIFICATORI
Cos’è un amplificatore per patch-clamp? È uno strumento che contiene i circuiti necessari per misurare le correnti elettriche che passano attraverso i canali ionici o le variazioni di potenziale della membrana cellulare.
Perché viene utilizzato? Per misurare variazioni di corrente o di voltaggio. L’amplificatore contiene i circuiti necessari per misurare la corrente che passa attraverso la membrana cellulare sia in termini di intensità che di direzione.
L’amplificatore permette anche di misurare il potenziale della membrana cellulare in risposta al movimento della corrente. Per dare inizio al movimento della corrente, lo sperimentatore può somministrare un comando di voltaggio alla cellula e la cellula risponderà facendo passare la corrente necessaria per mantenere tale comando di voltaggio. In alternativa, lo sperimentatore può anche iniettare corrente e poi misurare la modifica del potenziale di membrana causato da tale variazione di corrente. La scelta del punto in cui amplificare e filtrare il segnale di interesse ha implicazioni sulla fedeltà del segnale. La posizione ideale per amplificare il segnale è all’interno dello strumento di registrazione. Tutti i modelli di amplificatori Axon™ utilizzano questa strategia con controllo variabile del guadagno sul segnale in uscita per garantire un’amplificazione a basso rumore della corrente della pipetta o del potenziale di membrana. Il posizionamento dell’amplificazione all’interno dello strumento di registrazione riduce al minimo l’estensione del circuito tra il segnale a basso livello e il circuito di amplificazione, limitando le fonti di rumore esterne.
Amplificatori disponibili: Axopatch™ 200B, MultiClamp™ 700B, Axoclamp™ 900A
DIGITALIZZATORI
Cos’è? Il digitalizzatore è uno strumento per l’acquisizione di dati che converte segnali analogici in segnali digitali.
Perché viene utilizzato? I digitalizzatori acquisiscono dati per l’analisi.
Il segnale di corrente acquisito dall’amplificatore è un segnale analogico, ma per eseguire l’analisi dei dati necessaria per le misurazioni di patch-clamp ad alta risoluzione, il segnale analogico deve essere convertito in un segnale digitale. Posizionato tra l’amplificatore e il computer, il digitalizzatore esegue questa importante operazione. La qualità del segnale ricevuto dal computer è estremamente importante ed è determinata dalla frequenza di campionamento o tasso di campionamento. L’ultima generazione di digitalizzatori Digidata® ha la capacità di eseguire il campionamento a 500 kHz ed è equipaggiata con la funzione HumSilencer™, che permette di eliminare il rumore alla frequenza di linea di 50/60 Hz.
Amplificatori disponibili: Sistema di acquisizione dati a basso rumore Digidata 1550B più HumSilencer
SOFTWARE
Cos’è? Il software di acquisizione e analisi dei dati di patch-clamp è la vostra interfaccia con l’amplificatore, il digitalizzatore e qualsiasi altro componente elettronico per patch-clamp.
Perché viene utilizzato? Per eseguire l’acquisizione e l’analisi dei dati e per controllare il digitalizzatore e l’amplificatore.
Mentre l’insieme dell’amplificatore e del digitalizzatore contiene i circuiti chiave per l’esecuzione di un esperimento di patch-clamp, il software controlla questi strumenti in modo che somministrino il potenziale desiderato e misurino la corrente o il voltaggio risultanti. Inoltre, il software analizza i dati acquisiti con le impostazioni definite dall’utente, che possono includere filtrazione, normalizzazione, rimozione del rumore, adattamento della curva e determinazione dei parametri.
Amplificatori disponibili: Software 11 pCLAMP™
HEADSTAGE
Cos’è? Dispositivo che contiene le micropipette con circuiti integrati per la trasmissione dei segnali elettrici dalle micropipette all’amplificatore.
Perché viene utilizzato? Il segnale elettrico acquisito dalla micropipetta deve essere trasmesso ai sistemi di amplificazione per l’elaborazione del segnale.
Ogni headstage è specificamente regolato per l’amplificatore. Tutti gli headstage contengono circuiti elettrici critici che riducono il rumore. Gli headstage sono anche controllati meccanicamente dal micromanipolatore.
Headstage disponibili: headstage Axon
MICROSCOPIO CON MICROMANIPOLATORI
Cos’è? Il microscopio è uno strumento di ingrandimento ottico. Il micromanipolatore è un dispositivo che manovra meccanicamente la micropipetta con precisione nanometrica, permettendo solitamente di eseguire movimenti nelle 3 dimensioni.
Perché viene utilizzato? Per posizionare in modo stabile e preciso la micropipetta nell’area della membrana cellulare, che è un aspetto cruciale per una registrazione efficace.
Il posizionamento accurato di un elettrodo di patch su una cellula di 10-20 µm richiede un sistema ottico in grado di garantire un ingrandimento di fino a 300 o 400 volte con miglioramento del contrasto (ad es. Nomarski/DIC, Phase o Hoffman) e un micromanipolatore che permetta di posizionare stabilmente l’elettrodo nello spazio 3D. È preferibile utilizzare un microscopio invertito perché consente di accedere più facilmente agli elettrodi dal di sopra della preparazione e offre anche una piattaforma più ampia e più solida per fissare il micromanipolatore. Un micromanipolatore ha la capacità di muovere l’elettrodo per distanze molto piccole lungo gli assi X, Y e Z. Inoltre, permette poi di mantenere tale posizione a tempo indefinito.
GABBIA DI FARADAY E TAVOLO AD ARIA/ANTI-VIBRAZIONI
Cos’è? Un tavolo e una gabbia intorno all’allestimento di patch-clamp per isolare le fonti di interferenza.
Perché viene utilizzato? Per schermare l’allestimento dalle interferenze esterne.
Le correnti elettriche misurate durante gli esperimenti di patch-clamp possono essere estremamente piccole (nell’ordine dei picoampere) e qualsiasi minima fonte di interferenza, come le onde radio, può distorcere o nascondere questi segnali. Una gabbia di Faraday è una struttura costituita da una rete metallica posta intorno al microscopio e alla camera di registrazione; è utile per evitare che gli elettrodi captino fonti di rumore esterne. Inoltre, piccole fonti di vibrazioni nell’ordine dei picometri possono disturbare la registrazione. Pertanto, tutti i componenti devono essere perfettamente posizionati nel corso dello svolgimento dell’esperimento e vengono utilizzati tavoli ad aria o anti-vibrazioni per isolare l’allestimento dalle fonti esterne di vibrazione che potrebbero compromettere questo allineamento.
