Gli organoidi derivati dal paziente (Patient-Derived Organoids, PDO o semplicemente “organoidi”) sono spesso menzionati in relazione alla scoperta di farmaci e alla ricerca medica. Questo articolo spiega cosa sono i PDO e come gli scienziati li ricavano e li sviluppano dal tessuto donato del paziente. Questi metodi di biologia 3D sono relativamente nuovi e questo campo di ricerca si sta sviluppando rapidamente.

Scopri tutto su come far crescere i PDO, tra cui:

Gli organoidi sono versioni microscopiche 3D degli organi da cui hanno origine. Ad esempio, i “gommi” in miniatura possono essere derivati da tessuto bioptico sano o malato proveniente dall’intestino di un paziente. È importante sottolineare che i PDO sono replicati fedeli del tessuto da cui provengono, compresi i diversi tipi di cellule e qualsiasi malattia sottostante.

L’immagine è di un organoide del tumore colorettale o “mini-intestino”. La colorazione blu mostra il DNA nelle singole cellule e il colore giallo mostra spazi all’interno della struttura equivalenti alla cavità intestinale. Un intero PDO 3D è mostrato a sinistra e a destra è possibile vedere una sezione al centro

Derivare e far crescere gli organoidi in laboratorio è laborioso, tecnicamente impegnativo e costoso. Richiede la competenza di scienziati esperti e apparecchiature costose, a parte le considerazioni etiche e le autorizzazioni per lavorare con il tessuto umano. (La Legge sui tessuti umani 2004 regola le attività relative alla rimozione, conservazione, uso e smaltimento del tessuto umano). Tuttavia, lo sforzo ne vale la pena, poiché le strutture risultanti vengono sempre più utilizzate per aiutare gli scienziati a comprendere come funziona l’organismo e come modello su cui testare potenziali nuovi farmaci.

Cosa sono gli organoidi derivati dal paziente?

I PDO sono strutture cellulari 3D che derivano da “cellule staminali adulte” all’interno del tessuto del paziente che possono rigenerarsi per mantenere e riparare il tessuto danneggiato. Hanno “istruzioni pre-programmate” per dividere e formare i tipi di cellule specializzate presenti nel loro organo di origine specifico. Le cellule, una volta formate, si autoassemblano per replicare la stessa “architettura” presente nel corpo. Le strutture che formano sono quindi chiamate organoidi perché sono “come un organo”. I PDO possono essere derivati da molti organi come intestino, cuore, fegato, rene, pancreas, polmone, cervello e molti altri. Le piccole dimensioni e la riproduzione fedele del tessuto del paziente al di fuori del paziente consentono agli scienziati di utilizzare i PDO per esperimenti multipli in laboratorio che non potevano essere eseguiti eticamente sui pazienti stessi! Ad esempio, per testare e prevedere accuratamente le risposte dei pazienti a nuovi farmaci.

Come un albero di bonsai o un’anguria, i PDO sono solo versioni più piccole dell’originale. È necessario un microscopio per poterli osservare in qualsiasi dettaglio. Il diametro di una sezione dell’intestino tenue dell’intestino è di circa 3 centimetri (0,03 metri) e un organoide del mini-intestino coltivato per alcuni giorni in laboratorio è di circa 75 micrometri (0,000075 metri), vale a dire400, volte più piccolo.

Da dove provengono i PDO?

Il tessuto da cui ricavare gli organoidi viene generosamente donato con il consenso del paziente. Di solito, ciò deriva da un’agobiopsia eseguita da un medico per accertare se il tessuto è sano o se il paziente è affetto da tumore o da un’altra malattia. Sono sufficienti pochi millimetri della biopsia. Le possibilità di stabilire organoidi in coltura sono maggiori con più tessuto, ma non è ancora possibile garantire che gli organoidi possano essere derivati da ogni campione.

Creazione di organoidi “mini-intestino” dal tessuto intestinale del paziente: Un processo passo-passo

La procedura per la derivazione di organoidi dal tessuto del paziente varia a seconda del tipo di tessuto. I diversi laboratori hanno i propri metodi preferiti che sono personalizzati in base alle loro esigenze. Più impariamo sul processo, più efficienti e di successo stanno diventando i metodi. L’esempio seguente è una panoramica generale delle fasi coinvolte nella creazione di “mini-gomme” dal tessuto intestinale. Il processo, dalla ricezione del campione nel laboratorio di ricerca, alla coltura in incubatore, in preparazione alla formazione degli organoidi, richiede circa 4 ore. La crescita degli organoidi richiede circa 2 settimane dalla preparazione dei tessuti.

1. Il tessuto bioptico del paziente viene assegnato ai vari esami necessari per la diagnosi. Il piccolo pezzo per la derivazione degli organoidi viene posto in una speciale soluzione di conservazione e raffreddato per mantenere le cellule in vita e funzionanti normalmente mentre viene trasportato al laboratorio di ricerca. (La stessa soluzione viene utilizzata per tutti gli organi necessari per il trapianto).
2. In laboratorio, il campione reso anonimo viene spruzzato con alcol al 70% e collocato in una cappa di sicurezza biologica (BSC). L'armadio produce flussi d'aria che passano tra l'operatore e il campione. In questo modo si mantiene l'isolamento reciproco di entrambi.
3. Il campione viene sciacquato con un liquido contenente sostanze nutritive e sali (“supporti”) e tritato molto finemente in una piastra di Petri utilizzando bisturi.
4. Viene aggiunta una soluzione enzimatica e la miscela viene incubata in un bagnomaria a temperatura corporea (37 °C) per circa 30 minuti. Ciò scompone la struttura del tessuto e rilascia le “cellule staminali adulte” che consentiranno agli organoidi di formarsi.
5. La digestione enzimatica viene interrotta con il terreno e la miscela viene centrifugata ad alta velocità all’interno di una centrifuga. Il pellet risultante viene risospeso in terreni freschi. Questo passaggio può essere ripetuto diverse volte per “lavare” il campione.
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7. Il pellet contenente piccoli grumi di cellule/frammenti tissutali viene raffreddato a 4 °C e risospeso con cautela in una miscela proteica gelatinosa come Matrigel o suo equivalente. Matrigel è liquido a 4 °C e forma un gel a temperatura ambiente. Questo idrogel fornisce fattori di crescita e supporto strutturale per lo sviluppo delle cellule in tre dimensioni. Le cellule si formano in una palla che può essere piuttosto arrotondata come un pallone con o senza sporgenze. Alcuni organoidi possono avere una forma piuttosto irregolare.
8. Piccoli blob del frammento cellulare e della miscela Matrigel vengono collocati su piastre di Petri sterili. Questi blob hanno approssimativamente le dimensioni di una goccia media di acqua, vale a dire 0,05 ml. I blob vengono lasciati gelificare a temperatura ambiente. Viene aggiunto un alimentatore di liquido. Contiene nutrienti e fattori aggiuntivi che incoraggiano la crescita e lo sviluppo degli organoidi senza alterare la biologia delle cellule. La piastra viene quindi spostata in un incubatore che mantiene una temperatura costante di 37 °C e 5% di anidride carbonica. (Condizioni standard di coltura cellulare).
9. Il mangime liquido viene rinnovato ogni pochi giorni e gli organoidi si svilupperanno entro circa 2 settimane. La resa è molto variabile con qualsiasi cosa, dagli 0 a 100 organoidi agli organoidi per biopsia. Ciò può dipendere dal tipo di tessuto e dalla quantità di campione bioptico originale.

Come espandere il numero di organoidi

Una volta stabiliti completamente, i PDO possono essere suddivisi per creare molte altre copie. Ciò può essere fatto in pochi giorni o ogni poche settimane e varia a seconda del tipo di organo e della persona, poiché i PDO derivati da ciascun paziente sono unici. Le cellule staminali adulte all’interno dei frammenti di organoidi genereranno nuove cellule e formeranno organoidi nello stesso modo in cui si formano dal campione di tessuto originale, tranne per il fatto che si formano più rapidamente dopo che sono già state stabilite. Il processo di divisione e reinserimento di più copie è noto come “sottocoltura” o “passaggio” e può essere ripetuto più volte, con conseguente molte copie aggiuntive. Questi possono essere utilizzati per ricerche su piccola scala sulla genetica e sulle malattie.

Metodo per una sottocoltura di organoidi (passaggio)

1. Sciogliere il Matrigel che circonda gli organoidi
2. Far passare gli organoidi verso l’alto e verso il basso attraverso l’apertura stretta del puntale di una pipetta per dissociarli meccanicamente o rompere i cluster cellulari utilizzando una soluzione chimica contenente enzimi.
3. Centrifugare per pellettare le cellule, rimuovere il liquido.
4. Miscelare le cellule/i frammenti degli organoidi con Matrigel fresco e coltura come prima.

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