produzione di organoidi su scala industriale: sfide, vantaggi e soluzioni;
La consapevolezza che le linee cellulari 2D non hanno la complessità di rappresentare i sistemi biologici umani ha incoraggiato gli scienziati a cercare strumenti di coltura in vitro più avanzati per la ricerca biomedica. Recenti progressi hanno portato alla creazione di modelli 3D come sferoidi e organoidi.
Gli sferoidi sono generalmente aggregati flottanti di molteplici tipi di cellule e sono probabilmente di bassa complessità nell’organizzazione tumorale speculare. Al contrario, gli organoidi sono definiti dalla loro capacità di autoassemblarsi dalle cellule staminali differenziate in una disposizione spaziale che rispecchia l’organo corporeo che rappresentano, ricapitolando la struttura e la funzione biologica dell’organo, ma su scala miniaturizzata. Gli organoidi sono quindi un modello fisiologicamente rilevante per lo studio delle malattie umane e la valutazione dell’efficacia e della sicurezza dei farmaci; ad esempio, gli organoidi imitano la risposta del paziente quando entrambi vengono trattati con gli stessi farmaci. Possono essere prodotti organoidi che rappresentano tessuto malato o sano proveniente dalla maggior parte degli organi del corpo.
Di conseguenza, i modelli cellulari degli organoidi offrono la possibilità di accelerare la pipeline di sviluppo del farmaco, riducendo l’elevato tasso di abbandono nelle sperimentazioni cliniche e i costi associati.
Tuttavia, affinché questo diventi diffuso e compatibile con le applicazioni di screening ad alto rendimento, è necessaria la produzione di organoidi su larga scala.
Scalare la produzione di organoidi per garantire coerenza, riproducibilità e rilevanza statistica quando il test è difficile. In questo podcast, gli esperti di organoidi Victoria Marsh Durban, Direttore dei servizi personalizzati per organoidi presso Molecular Devices e Magdalena Kasendra, Direttore della ricerca e dello sviluppo presso il Centro per la medicina delle cellule staminali e degli organoidi presso il Cincinnati Children’s Hospital, discutono dei vantaggi e delle sfide della produzione industriale di organoidi.
Principi base della produzione di organoidi
Gli organoidi solitamente derivano da cellule staminali pluripotenti o adulte.
Le cellule staminali pluripotenti (PSC) possono essere ottenute dai fibroblasti cutanei o dalle cellule mononucleate del sangue periferico dei pazienti. Sono autorinnovanti e possono essere riprogrammati per differenziarsi in più tipi di cellule. Quando si utilizzano le PSC, è necessario ricapitolare lo sviluppo embrionale in vitro in un complesso processo multifase, che prevede l’applicazione di diversi fattori di crescita per generare caratteristiche di più lignaggi cellulari. Ciò induce la differenziazione in più tipi di organoidi (ad es. cervello, polmone, cuore, rene e fegato) dalle stesse cellule originali, da cui il termine cellule staminali pluripotenti indotte (induced pluripotent stem cells, iPSC).
Esempi di modelli cellulari 3D dall’alto a sinistra: organoide cerebrale, organoidi polmonari, cardioide (organoide cardiaco) e modello epatico 3D.
Le cellule staminali adulte, provenienti da campioni bioptici di pazienti o tessuto resecato, hanno un meccanismo cellulare innato che le “costringe” a differenziare il percorso richiesto per ricreare il tessuto da cui hanno avuto origine. In altre parole, possono formare organoidi spontaneamente in laboratorio quando coltivati in matrici extracellulari e dati fattori di crescita specifici per il tessuto appropriati.
In generale, la produzione di organoidi da cellule staminali adulte isolate da biopsie tissutali primarie del paziente è più semplice rispetto all’uso di iPSC.
Sfide coinvolte nella produzione di organoidi
La ricerca sugli organoidi è ancora nuova e in crescita, quindi gli scienziati devono affrontare sfide di ottimizzazione e aumento della produzione di organoidi indipendentemente dal tipo di cellule staminali utilizzato come punto di partenza.
Una delle principali sfide nell’uso di organoidi derivati da cellule staminali adulte è correlata al processo di coltura cellulare che deve essere eseguito interamente in 3D utilizzando idrogel. Questo processo è molto più impegnativo e dispendioso in termini di tempo rispetto alla cultura 2D.
I flussi di lavoro basati su PSC comportano complicazioni aggiuntive a causa della difficoltà di manipolarle nei modelli di differenziazione desiderati. Magdalena afferma: “Quando si utilizzano iPSC, dobbiamo ricapitolare lo sviluppo embrionale in vitro attraverso l’introduzione di diversi fattori di crescita per simulare vari lignaggi cellulari”. Fortunatamente, queste limitazioni possono essere superate oggi con lo sviluppo di bioprocessi altamente automatizzati all’avanguardia.
I bioreattori sono stati ampiamente utilizzati nella coltura di organoidi (sia a base di iPSC che di cellule staminali adulte) in condizioni ambientali attentamente monitorate; tuttavia, ulteriori sfide sono associate al loro uso. Nello specifico, la transizione dalla crescita iniziale nelle matrici a base di idrogel alla sospensione nei bioreattori richiede molta attenzione.
Mentre sono sospesi in un idrogel, gli iPSC non sono esposti ad alcuna stimolazione meccanica. Tuttavia, collocarli in una sospensione 3D li sottopone a stress di taglio in rapida evoluzione, che può influire sul tasso di crescita e sulla differenziazione. Mentre bassi livelli di stress da taglio favoriscono la differenziazione, livelli eccessivi possono indurre danni cellulari e morte. Pertanto, lo stress di taglio del bioreattore deve essere attentamente ottimizzato per ottenere gli stati di differenziazione desiderati senza perdere la resa degli organoidi. Le strategie attuali includono la regolazione della velocità di rotazione del bioreattore o l’uso di un bioreattore privo di stress da taglio. La strategia ottimale dipende dagli esatti requisiti di crescita e differenziazione per l’organoide di interesse e garantisce che l’idrogel che trasporta le cellule staminali iniziali sia compatibile con il bioreattore. Gli idrogel morbidi, per esempio, possono rompersi nei bioreattori a causa dello stress da taglio, mettendo a rischio l’integrità degli aggregati delle cellule staminali.
Un’altra sfida è la difficoltà di ottenere il materiale sorgente per le cellule staminali adulte, vale a dire trovare una linea di organoidi originale idonea o materiale bioptico primario del paziente. Attualmente, la maggior parte della ricerca sugli organoidi viene condotta in istituti di ricerca affiliati al mondo accademico, dove gli organoidi vengono prodotti esclusivamente per scopi di ricerca senza scopo di lucro. Tuttavia, la traduzione dal mondo accademico all’ambiente commerciale, come le aziende farmaceutiche, solleverà inevitabilmente preoccupazioni etiche. Il consenso etico dovrà essere preso in considerazione quando si commercializzano colture di organoidi da campioni di pazienti.
Gli organoidi colorettali possono essere utilizzati per studiare malattie come la malattia infiammatoria intestinale (IBD).
Anche la riproduzione di colture di organoidi da organoidi originali può essere complicata a causa delle variazioni tra diversi protocolli di ottimizzazione della linea cellulare. Per esempio, la coltura degli organoidi cerebrali (cervello) comporta il trasferimento delle SCP in un mezzo di induzione neuronale prima di coltivarle in goccioline di idrogel. Secondo Victoria, “I protocolli possono variare significativamente a seconda del tipo di tessuto sorgente, ad esempio se si tratta di un tessuto canceroso e del tipo di tumore a cui appartiene. Ecco perché potrebbe essere necessario ottimizzare il flusso di lavoro di produzione linea per linea, il che richiede un occhio esperto”.
Un singolo errore nell’implementazione del protocollo può spingere la linea cellulare per differenziarsi in un fenotipo indesiderato.
Vantaggi della scalabilità degli organoidi
Sebbene aumentare la produzione di organoidi possa rivelarsi impegnativo, i premi possono essere considerevoli.
Secondo Magdalena, uno dei principali vantaggi è la facilità di traduzione nel panorama biofarmaceutico: “La scalabilità rende gli organoidi suscettibili agli standard del settore e alle pratiche normative, in modo che possano essere impiegati più facilmente nella scoperta farmacologica, nella terapia con cellule staminali e nelle applicazioni di medicina personalizzata”.
La produzione batch su larga scala di organoidi può essere vantaggiosa sia per la ricerca accademica che per quella industriale. La realizzazione di grandi lotti di organoidi consente a scienziati e produttori di condurre esperimenti più ampi con saggi ad alto rendimento.
Victoria aggiunge che grandi lotti di organoidi possono mitigare la variabilità da lotto a lotto: “In particolare, i reagenti di origine animale utilizzati nella produzione di organoidi spesso provengono da una varietà di fonti. Questi reagenti in crescita sono derivati specificamente per esperimenti su piccola scala. Ciò significa che ogni volta che si desidera far crescere gli organoidi, si utilizzerà un reagente diverso, che indica una mancanza di standardizzazione degli organoidi”.
Infine, l’implementazione di bioreattori compatibili può aiutare i ricercatori a monitorare le condizioni ambientali, come lo stress da taglio, più facilmente, migliorando in ultima analisi la coerenza e quindi la riproducibilità.
Organoidi: La potenza predittiva del 3D
La maggiore enfasi sulla ricerca sugli organoidi è principalmente dovuta al fatto che gli organoidi sbloccano una visione più approfondita dell’architettura tissutale e delle interazioni cellula-cellula, il che aumenta la potenza predittiva nel processo di scoperta farmacologica. Ad esempio, per identificare i farmaci più efficaci per i pazienti con forme specifiche di fibrosi cistica sono stati utilizzati “mini-guts” (1). Modelli simili, sviluppati da pazienti affetti da tumori gastrointestinali, si sono dimostrati predittivi dell’impatto delle terapie nei pazienti stessi (2). Più recentemente, è stata utilizzata una vasta gamma di tipi di organoidi per modellare l’impatto dell’infezione da SARS-CoV-2 in vari tessuti e identificare varie terapie (3).
Gli organoidi intestinali sono modelli di microtessuto 3D che riproducono strutture presenti nel lume intestinale e sull’epitelio intestinale circostante. Inoltre, può simulare le funzioni intestinali fondamentali, come l’assorbimento di nutrienti e la secrezione di muco.
Questo miglioramento della predittività significa che gli organoidi possono identificare i fallimenti dei farmaci candidati all’inizio della pipeline di scoperta dei farmaci ed eliminare i falsi positivi (ovvero, candidati che non hanno avuto successo in contesti clinici nonostante la loro promessa nella ricerca preclinica) molto prima nel processo.
Gli organoidi sono promettenti anche nell’ambito della medicina personalizzata. Le cellule staminali specifiche del paziente danno origine a organoidi che si congruiscono con la composizione genetica e le caratteristiche fisiologiche del paziente. Pertanto, gli organoidi diventeranno preziosi quando si sviluppano terapie su misura per i soggetti affetti da malattie genetiche rare e tumori resistenti al trattamento.
L’uso più diffuso di organoidi può anche ridurre l’uso di modelli animali. Proprio come i modelli cellulari 2D, anche i modelli animali sono inadeguati nel predire la risposta del paziente, quindi il loro ampio uso comporta un rischio di fallimento clinico. Vi è anche l’ulteriore pressione delle preoccupazioni etiche sull’uso degli animali nella scoperta farmacologica. Con l’istituzione dell’atto di modernizzazione della FDA, i ricercatori hanno iniziato a cercare strategie alternative ai modelli animali.
L’uso di organoidi come piattaforma in vitro per lo sviluppo di farmaci e lo studio di meccanismi patologici, insieme ai cambiamenti di legge, ci consentirà di ridurre il numero di animali utilizzati nella ricerca. L’adozione degli organoidi acquisirà trazione man mano che gli scienziati si renderanno conto del loro valore e acquisiranno necessariamente le competenze e l’esperienza necessarie per utilizzarli in laboratorio. L’accesso alle linee degli organoidi e lo sviluppo di saggi per sfruttare appieno questo complesso modello in vitro incentrato sull’uomo amplieranno notevolmente il campo degli organoidi e ci porteranno in una nuova era di ricerca nel settore delle scienze naturali.
- Saini, Angela. “I pazienti affetti da fibrosi cistica traggono beneficio dal mini-intestino”. Cellula staminale cellulare 19,4 (2016): 425-427.
- Vlachogiannis, Georgios, et al. “Gli organoidi derivati dal paziente modellano la risposta al trattamento dei tumori gastrointestinali metastatici”. Scienza 359,6378 ( 2018): 920-926.
- Han, Yuling, et al. “Modelli di organoidi umani per studiare l’infezione da SARS-CoV-2”. Metodi della natura 19,4 (2022): 418-428.