La garanzia di monoclonalità è indubbiamente cruciale nello sviluppo di linee cellulari per la generazione di composti terapeutici, come anticorpi monoclonali o terapie basate su cellule. Per utilizzare una linea cellulare per l’uso terapeutico, un ricercatore deve dimostrare che le cellule in una colonia sono state prodotte da una singola cellula. La semplice visualizzazione delle colonie nei pozzi della piastra o l’uso di un livello di affidabilità della linearità non costituisce una prova sufficiente della linearità se non esiste un modo chiaro di monitorare la crescita delle colonie da una singola cellula. Ora, cos’altro si può fare per produrre linee di cellule monoclonali e convalidarne la linearità?

Le soluzioni CloneSelect ^® di Molecular Devices presentano le tecnologie per il flusso di lavoro necessarie per lo sviluppo di linee di cellule monoclonali. Recentemente abbiamo discusso le attuali sfide e opportunità per migliorare l’ingegneria delle linee di cellule staminali con Gargi Roy, uno scienziato del Dipartimento dello sviluppo biofarmaceutico di AstraZeneca.

In precedenza, Roy e il suo team di ricerca utilizzavano il ClonePix ^® FL per produrre gli anticorpi monoclonali terapeutici dalle cellule dell’ovaio di criceto cinese (CHO) [1]. Quando hanno spostato la loro attenzione sull'ingegneria delle cellule staminali, è diventato chiaro che i due flussi di lavoro avevano differenze malgrado il filettatura comune della produzione di anticorpi monoclonali.

Il team di terapia con cellule staminali di AstraZeneca ha utilizzato i nostri prodotti CloneSelect per l’ingegneria delle cellule staminali e lo sviluppo monoclonale. Inoltre, Roy ha illustrato in dettaglio come il suo team fa crescere le linee cellulari con maggiore precisione con l’aiuto delle soluzioni di selezione dei cloni di Molecular Devices. Questo articolo tratta anche quanto segue:

I due principali metodi di ingegneria delle cellule staminali sono i seguenti:

1. Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC): Vengono convertiti da celle somatiche attraverso l'introduzione di fattori di trascrizione.
2. Cellule staminali embrionali (ESC): Derivato da cellule di massa interne embrionali indifferenziate.

Ciò che entrambi i tipi di cellule staminali hanno in comune è che è possibile indurle a produrre anticorpi monoclonali. Inoltre, gli anticorpi monoclonali mediati da cellule sintomatiche possiedono determinati vantaggi rispetto agli anticorpi monoclonali ricombinanti, come una migliore penetrazione nell’area malata e una maggiore velocità di attraversamento della barriera ematoencefalica (BBB). [2].

Isolamento a cella singola con la stampante a cella singola CloneSelect

La prima domanda che ci si potrebbe porre è, cosa fa risaltare le nostre soluzioni di flusso di lavoro CloneSelect nel fare linee di cellule monoclonali e nella successiva valutazione della linearità? Immaginiamo di essere in grado di depositare contemporaneamente una singola cellula in un pozzetto e di garantire la linearità con una prova visiva al momento dell’ordine.

La serie di stampanti a cella singola CloneSelect garantisce un isolamento a cella singola senza soluzione di continuità e promuove la massima crescita clonale grazie alla sua delicata erogazione cellulare, eliminando al contempo la possibilità di contaminazione trasversale con altre linee cellulari. Il suo principio di funzionamento risiede nella sua tecnologia microfluidica che racchiude delicatamente le singole cellule in goccioline liquide e le seme in un pozzo. Inoltre, cattura cinque immagini per ogni cella erogata, fornendo una prova basata su immagini dell’isolamento e della deposizione di una singola cellula al momento dell’ordine.

Per un sistema così intricato, la stampante a cella singola CloneSelect è facile da utilizzare con il nostro software proprietario. Una volta che il vostro laboratorio avrà completato un breve corso di formazione con il nostro team di Field Application Scientists, beneficerete immediatamente del suo design intuitivo e intuitivo. Il termine “compatibile con le cellule” si riferisce a due cose:

1. Assenza di laser ad alta energia (la cordialità delle cellule si ottiene attraverso microfluidica delicata, alimentata per gravità)
2. Piccoli volumi di erogazione (nessun rifiuto e nessuna contaminazione da campione a campione)

Forse la cosa più importante è che la stampante a cella singola CloneSelect ha acquisito immagini di celle di alta qualità basandosi sui criteri di esclusione che si basano sulla forma, sulle dimensioni e sul rapporto degli assi delle celle. Attraverso i criteri di esclusione, è possibile clonare sia le cellule parentali che le cellule ingegnerizzate con le proprietà desiderate.

Come creare linee di cellule monoclonali: Il flusso di lavoro generalizzato

Che si lavori con iPSC, ESC o molti altri tipi di cellule, il flusso di lavoro sintetizzato di seguito costituisce la base della produzione di linee di cellule monoclonali:

1. Stampa a cella singola: Isolare una singola cellula per iniziare una colonia
2. Espansione e caratterizzazione cellulare: Formare le colonie e valutare la linearità e assicurarsi che le cellule esprimano le proteine di interesse eseguendo test genotipici/fenotipizzati
3. Linee di cellule clonali: Differenziazione specifica per tipo di cellula

Un semplice flusso di lavoro per iniziare con qualsiasi popolazione cellulare, compresa la cellula parentale, e utilizzato per clonare qualcosa o una cellula ingegnerizzata per rendere le cellule qualsiasi proprietà desiderata.

Sfide nell’isolamento a singola cellula e nella crescita clonale

Anche con le più all'avanguardia delle tecnologie di isolamento a cella singola e i flussi di lavoro di linearità, è ancora possibile affrontare alcune difficoltà.

Secondo Gargi Roy, la principale difficoltà è emersa per il suo team quando desideravano stampare le celle in più piastre e formare più colonie con le stesse caratteristiche . Con l’aumentare del numero di ripetizioni di isolamento a cella singola, si osserva spesso un calo costante dell’efficienza della crescita in uscita clonale. Il calo è ancora più nitido quando si desidera adottare condizioni ACF (pile component-free), che è necessario considerare se la ricerca senza animali è fondamentale per la propria istituzione.

Le divergenze nell’efficienza della crescita in uscita clonale sono più evidenti negli ESC che negli iPSC. L'efficienza scende a cifre singole con ESC ingegnerizzati. Il motivo principale del calo è il calo della vitalità cellulare durante la piastratura, afferma Roy. Evidenzia inoltre il miglioramento del design sperimentale arricchendo il terreno, specialmente in condizioni ACF.

Le differenze nelle efficienze di crescita della colonia da singole celle tra IPSC ed ESC illustrano significative differenze nelle ESC.

Anche quando c'è una crescita clonale sufficiente, si deve fare molta attenzione per prevenire l'apoptosi. Una raccolta tempestiva di 8-10 giorni è fondamentale. Aiuterebbe a sfamare la colonia ogni giorno per prevenire la fame.

L'aggregazione delle cellule è un altro problema che ostacola la valutazione della linearità. È necessario utilizzare il corretto reagente di dissociazione per staccare le cellule dalla superficie del pozzetto e l'una dall'altra, un passaggio fondamentale per l'analisi a valle .

Difficoltà di garanzia durante lo sviluppo di linee di cellule monoclonali

La verifica della linearità è fondamentale per lo sviluppo della linea cellulare. È necessario fornire una prova dettagliata del fatto che la propria popolazione cellulare è derivata da una singola cella per l’archiviazione regolamentare. Il team di Roy ha trovato gli ESC particolarmente difficili da monitorare a causa della loro superficie appiccicosa e delle forme irregolari. Se due ESC in prossimità fossero stati distribuiti, probabilmente sarebbero stati rilevati come una singola cellula. Inoltre, se ci si trova di fronte a una scadenza ravvicinata, si potrebbe applicare la limitazione della diluzione per le statistiche per calcolare la possibilità di sorveglianza.

La stampante a cella singola CloneSelect offre tecniche di diagnostica per immagini avanzate per dimostrare la linearità nel punto di isolamento a cella singola . La stampante non solo è in grado di distinguere facilmente tra due celle molto vicine durante la deposizione cellulare, ma consente anche di risalire alla colonia dal giorno della raccolta al giorno 0 per garantire la linearità come si vede nella figura seguente.

La conferma della linearità e l’acquisizione di immagini a cella singola con la stampante a cella singola CloneSelect

Caratterizzazione Clonale

Il componente finale dello sviluppo della linea cellulare è la Caratterizzazione. Una volta valutata la linearità, si assicura che questa linearità sia riflessa nel genotipo e nella pluripotenza. Le cellule della colonia hanno tutti livelli costanti della funzionalità desiderata? Cosa più importante, sono stabili dal punto di vista genomico, il che significa che possono conservare e trasferire il materiale genetico da una generazione all’altra? Infine, sono pluripotenti (cioè, possono differenziarsi in tre strati principali di germi - ectoderm, endoderm e mesoderm)? Le risposte sono ottenibili solo mediante lo screening di cloni ad alto rendimento.

È qui che l’imager CloneSelect può aggiungere valore alla tua ricerca attraverso una maggiore fiducia nella garanzia della monoclonalità. L’Immaginer CloneSelect contiene una tecnologia in campo chiaro senza etichette con imaging in fluorescenza personalizzabile, corredato da strumenti avanzati di analisi dei dati, tra cui misurazioni di confluenza, curve di crescita, generazione di report di linearità e anteprime della piastra per visualizzare rapidamente la crescita di colonia in ogni pozzetto.

Con l'alta risoluzione e la varietà delle modalità di imaging, è anche possibile rilevare i marker delle celle specifici per le celle del vostroclono . Ciò consente di confermare se le linee di cellule monoclonali hanno la funzionalità desiderata.

L'illustrazione seguente mostra la differenziazione degli ESCs monoclonali in tre strati di germi distinti, che presentano i rispettivi biomarcatori in ogni strato.

Celle stabili/di alta qualità che utilizzano la nostra stampante a celle singole, rendendo facile la sincronizzazione in tre strati di germi: endoderm, mesoderm ed ectoderm.

L’ambito di valutazione funzionale dell’Immaginer CloneSelect continua anche dopo aver iniziato la fase di differenziazione cellulare. Attraverso l'imaging in fluorescenza, è possibile monitorare le cellule mentre si differenziano per formare diversi strati di tessuto.

Come posso per saperne di più informazioni sulle linee di cellule monoclonali?

Dalla fase iniziale di placcatura alla crescita e alla differenziazione cellulare, lo sviluppo di linee di cellule monoclonali è più semplice utilizzando il nostro flusso di lavoro CloneSelect per la garanzia del sistema di cloni.

È possibile esaminare ulteriormente la ricerca del team di cellule dello stelo di AstraZeneca per ulteriori informazioni sul flusso di lavoro di garanzia della linearità della stampante a cella singola CloneSelect e dell’immaginetore CloneSelect. Nel recente webinar di Molecular Devices, Gargi Roy illustra le difficoltà e le soluzioni nella garanzia della monoclonalità con i dettagli della sua ricerca che mostrano come ingegnerizzare le linee di cellule monoclonali e valutare le cellule nella colonia.

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Partecipa al webinar on- demand, Sicurezza della monoclonalità utilizzando la stampante a cella singola CloneSelect e l’immaginetore CloneSelect nel flusso di lavoro ingegneristico delle cellule dello stelo umano (hSC), con il Dr. Roy .

1. Roy, Gargi, et al. “Lo screening sequenziale mediante ClonePix FL e la colorazione intracellulare facilitano l’isolamento di linee di cellule ad alto produttore per la produzione di anticorpi monoclonali”. Rivista dei metodi immunologici 451 ( 2017): 100-110.Roy, Gargi, et al. “Lo screening sequenziale mediante ClonePix FL e la colorazione intracellulare facilitano l’isolamento di linee cellulari ad alto produttore per la produzione di anticorpi monoclonali”. Giornale dei metodi immunologici 451 (2017): 100-110.
2. Frank, Richard T e altri. “Revisione concisa: come piattaforma emergente per la terapia anticorpale del cancro”. Cellule staminali (Dayton, OH) vol. 28,11 ( 2010): 2084-7. doi:10.1002/stem.513.Frank, Richard T et al. “Revisione concisa: le cellule staminali come piattaforma emergente per la terapia anticorpale del tumore”. Cellule staminali (Dayton, Ohio) vol. 28,11 (2010): 2084-7. doi:10.1002/stem.513.

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